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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9297 (2023) Citer cet article

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L'inhibition du facteur d'initiation eucaryote 4A a été proposée comme stratégie de lutte contre les agents pathogènes. Les rocaglates présentent les spécificités les plus élevées parmi les inhibiteurs d'eIF4A, mais leur potentiel anti-pathogène n'a pas été évalué de manière exhaustive chez les eucaryotes. L'analyse in silico des modèles de substitution de six résidus eIF4A1 aa critiques pour la liaison au rocaglate a permis de découvrir 35 variantes. L'amarrage moléculaire des complexes eIF4A:ARN:rocaglate et les essais de décalage thermique in vitro avec des variants eIF4A exprimés par recombinaison ont révélé que la sensibilité était corrélée à de faibles énergies de liaison déduites et à des changements de température de fusion élevés. Des tests in vitro avec du silvestrol ont validé la résistance prédite chez Caenorhabditis elegans et Leishmania amazonensis et la sensibilité prédite chez Aedes sp., Schistosoma mansoni, Trypanosoma brucei, Plasmodium falciparum et Toxoplasma gondii. Notre analyse a en outre révélé la possibilité de cibler d'importants agents pathogènes d'insectes, de plantes, d'animaux et d'humains avec des rocaglates. Enfin, nos découvertes pourraient aider à concevoir de nouveaux dérivés synthétiques de rocaglate ou des inhibiteurs alternatifs d'eIF4A pour lutter contre les agents pathogènes.

Cibler la traduction eucaryote est apparu comme une stratégie potentielle pour lutter contre les agents pathogènes1,2,3,4. Parmi les trois étapes qui constituent l'initiation de la traduction, l'allongement et la terminaison, l'initiation a suscité un intérêt particulier en tant que cible en raison des nombreux facteurs impliqués et de son effet limitant la vitesse sur la traduction globale5,6,7.

Le facteur 4A d'initiation de la traduction eucaryote hautement conservé (eIF4A), une hélicase à ARN à boîte DEAD dépendante de l'ATP, joue un rôle essentiel dans l'initiation de la traduction8,9. Il existe deux isoformes d'eIF4A, eIF4A1 et eIF4A2, avec des fonctions biochimiques équivalentes et une identité de séquence de 90 à 95 %10,11. L'expression des deux isoformes diffère considérablement, eIF4A1 étant présent dans presque tous les tissus pendant la croissance cellulaire active et eIF4A2 principalement dans les organes à faible taux de prolifération12.

Les rocaglates, une classe de flavaglines d'origine végétale contenant une structure cyclopenta [b] benzofurane, font partie des inhibiteurs d'eIF4A les plus puissants et les plus spécifiques connus13,14 (Fig. S1). Plus de 200 rocaglates naturels et synthétiques ont été décrits depuis que le rocaglamide A (RocA) a été isolé pour la première fois à partir d'acajou d'Asie (Aglaia sp.), le seul genre connu pour produire des rocaglates15,16,17,18. Les rocaglates bloquent les complexes eIF4A:ARN contenant des brins d'ARN avec des structures secondaires stables telles que des tiges-boucles ou des G-quadruplexes ainsi que des étirements de polypurine dans le 5'UTR, tous associés à des sous-classes d'ARNm, notamment des proto-oncogènes et des ARNm viraux19,20,21. Ces ARNm sont traités préférentiellement par eIF4A et sont souvent associés à des cellules proliférantes et à une régulation traductionnelle22,23,24. La préférence d'eIF4A pour dérouler les ARNm avec des structures secondaires stables dans leurs 5'UTR et l'avidité des rocaglites pour les complexes eIF4A:ARN résultants en font une approche potentiellement viable pour lutter contre les agents pathogènes en raison de leur faible toxicité pour les humains et les animaux25.

Des études in vivo ont démontré le potentiel thérapeutique des rocaglates dans le cancer. L'analogue synthétique zotatifine fait actuellement l'objet d'une étude clinique de phase 1/2 pour les tumeurs solides26 et d'une étude clinique de phase 1 à dose croissante pour le COVID-19, indiquant son potentiel d'activité antivirale ciblée sur l'hôte27. Plusieurs autres études ont montré l'efficacité des roaglates dans la prévention de la réplication de plusieurs virus à ARN, soutenant le potentiel des roaglates en tant que pan-antiviraux28,29,30,31,32,33.

Le potentiel anti-pathogène dépendant de eIF4A des rocaglites a été démontré pour Plasmodium falciparum et P. berghei, Candida auris et plusieurs autres agents pathogènes eucaryotes3,34 (voir Tableau S1). D'autres agents pathogènes sont résistants aux rocaglates, par exemple, Entamoeba histolytica et Leishmania donovani35,36 (voir tableau S1).

Les rocaglates se lient aux complexes eIF4A:ARN, conduisant à un complexe ternaire stable qui empêche le déroulement enzymatique de l'ARNm37,38. Sélectionnez aa dans la poche de liaison rocaglate / ARN - les positions eIF4A1 humaines 158, 159, 163, 192, 195, 199 - sont essentielles au mécanisme de serrage du rocaglate38,39,40. La structure cristalline de l'eIF4A1 humain en complexe avec RocA, l'ARN polypurine et un analogue de l'ATP non hydrolysable, montre que les rocaglites bloquent de manière réversible les ARNm sur eIF4A par le biais d'interactions d'empilement π – π entre les anneaux phényles A et B des rocaglites et deux purines dans l'ARN, et entre le cycle phényle C des rocaglates et le résidu d'acide aminé en position 16338. Les séquences eIF4A d'Aglaia spp. présentent des substitutions résistantes qui empêchent la formation de complexes à la fois en aa 163 (Phe à Leu) et en aa 199 (Ile à Met), et un parasite fongique d'Aglaia, Ophiocordyceps sp. BRM1, présente une autre résistance conférant une substitution à aa 163 (Phe à Gly)38,41.

Ici, nous présentons une analyse in silico des séquences eIF4A, ainsi qu'une analyse biochimique des séquences représentatives et des études in vitro avec des micro-organismes eucaryotes contenant des variantes non testées auparavant de eIF4A, fournissant une première image complète du potentiel anti-pathogène des rocaglites. Les résultats révèlent des scénarios évolutifs potentiels pour la résistance au rocaglate et donnent un aperçu des relations structure-activité qui pourraient éclairer la conception de roaglates de nouvelle génération ou d'autres inhibiteurs d'eIF4A.

Une recherche mondiale GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) des séquences eIF4A a produit 365 séquences uniques de protéines eIF4A1 et eIF4A2 - 78 protistes, 80 fongiques, 49 végétales et 158 ​​animales (tableau S2) . Parmi ceux-ci, 162 correspondaient à des agents pathogènes d'origine protiste (55), fongique (53) ou animale (54). Pour déterminer les interactions potentielles de ces protéines eIF4A avec les rocaglates, nous avons analysé les schémas de substitution de six résidus aa (positions humaines 158, 159, 163, 192, 195, 199) situés entre les motifs Ib et III de eIF4A38,39,42,43 ,44 (Fig. S2). Les modèles aa connus pour être associés à la sensibilité ou à la résistance aux rocaglates sont répertoriés dans le tableau S1.

Notre analyse a découvert 35 modèles AA. Quatre d'entre eux—T158, P159, Y163, F192, Q195, V199 ; TPFFQI ; TPFFQV ; TPYFQI - représentait 63% de toutes les séquences eIF4A connues et était présent dans les quatre principales lignées eucaryotes (Fig. S3). Plus de la moitié des motifs aa (24/35) étaient présents dans une seule lignée. Le modèle TPLFQM était présent dans toutes les espèces d'Aglaia productrices de rocaglate, y compris deux nouvelles espèces signalées ici, Aglaia stellatopilosa et Aglaia glabriflora (Fig. S2; Numéros d'accès ON844099 et ON844100, respectivement). Le motif TPGFQI était également présent chez une seule espèce : le parasite fongique d'Aglaia spp., Ophiocordyceps.

Parmi les 162 pathogènes analysés, nous avons identifié 24 profils aa. Les protistes contenaient la plus grande diversité (14), suivis des champignons (13) et des animaux (9) (tableau S2). Cinq modèles - TPYFQV, TPFFQI, TPLFQI, TPHFQV, TPFFQV - représentaient 53% de toutes les séquences pathogènes eIF4A (Fig. 1). Les deux tiers des motifs aa (16/24) étaient présents dans une seule lignée. Il est important de noter que quatre profils AA associés à la sensibilité aux rocaglates - TPYFQV, TPFFQI, TPYFQI, TPHFQI - ont pu être détectés dans 50 % des agents pathogènes analysés (Fig. 1). Un autre 14% des séquences (22/162) présentaient des motifs aa - TPLFQI, TPSFQI, TPGFQI - précédemment associés à la résistance aux rocaglates (tableau S1).

Représentation des modèles d'aa critiques pour la liaison au rocaglate dans les protéines eIF4A connues dans les trois principaux groupes d'agents pathogènes eucaryotes. Une analyse complète des protéines eIF4A connues codées par des agents pathogènes a révélé 24 modèles d'aa aux positions 158, 159, 163, 192, 195 et 199 (numérotation eIF4A1 humaine). Cinq motifs aa étaient présents dans les trois groupes d'eucaryotes (I), trois motifs étaient présents dans deux groupes (II) et seize motifs étaient présents dans un seul groupe (III). Des modèles connus pour fournir une sensibilité ou une résistance naturelle aux rocaglates ont pu être trouvés dans les trois groupes.

Les agents pathogènes et vecteurs potentiellement sensibles aux rocaglates comprennent Trichuris trichiura, Glossina morsitans, Aspergillus niger et Cryptosporidium sp.; les agents pathogènes potentiellement résistants comprennent Paragonimus westermani, Blumeria graminis et Leishmania sp. (Tableau S2).

Les tolérances de substitution aux six positions de liaison rocaglate étaient nettement différentes, quatre positions - 158, 159, 192, 195 - étant hautement conservées et les deux autres positions - 163, 199 - montrant différents degrés de variation (Fig. 2). Les positions d'acides aminés 158, 192 et 195 sont impliquées dans la liaison à l'ARN, et la position 159, bien qu'elle ne soit pas directement impliquée dans la liaison à l'ARN, est flanquée de trois résidus de liaison à l'ARN : 158, 160 et 161 (Fig. S2)42. La position 163 a montré un niveau élevé de tolérance aux substitutions, avec 14 aa différents occupant la position dans tous les eIF4A interrogés. Les six aa non détectés en position 163 - basique chargé positivement [Arg, Lys], aliphatique non polaire [Met, Pro], aromatique non polaire [Trp] et polaire [Thr] - ont été associés à la déstabilisation des hélices α [Pro ] ou la modulation des interactions des protéines avec les acides nucléiques [Arg]45,46,47. La position 199, partie d'une hélice α située entre les motifs II et III de eIF4A, présentait une tolérance quasi bimodale pour Ile ou Val, deux aa aliphatiques structurellement similaires d'hydrophobicité équivalente. Au niveau des codons, le passage de Ile à Val ne nécessite que le premier nucléotide pour passer de l'adénine à la guanine (AUA, AUU ou AUC à GUA, GUU ou GUC), et le passage de Ile à Met, observé uniquement à Aglaia , nécessite un changement du troisième nucléotide, la "position d'oscillation", dans l'un des codons Ile en guanine (AUA, AUU ou AUC en AUG)48.

Profils de substitution d'acides aminés à six positions connues pour être critiques pour la liaison au rocaglate. Six résidus aa - 158, 159, 163, 192, 195, 199 - dans la poche de liaison à l'ARN eIF4A se sont révélés critiques pour la liaison au rocaglate. Les tolérances de substitution naturelle à chacun des six résidus sur les 365 séquences eIF4A analysées ici ont révélé quatre positions hautement conservées - 158, 159, 192, 195 - et deux positions variables - 163 et 199. Parmi celles-ci, la dernière montre une distribution de fréquence quasi bimodale (I ou V), tandis que le premier montre une distribution de fréquence plus promiscuité, avec 14 aa différents tolérés dans cette position. La structure décrite ci-dessus correspond au motif aa TPFFQI ; le rocaglate montré interagissant avec le complexe eIF4A: ARN est le silvestrol. Les logos de séquence ont été générés avec Seq2Logo—2.050.

La conservation des résidus T158, P159, F192 et Q195, et la tolérance limitée pour Val et Ile en position 199, ont confirmé la position 163 comme déterminant clé de la sensibilité aux rocaglates38,39. Plusieurs des substitutions en position 163 - Glu, Asp, His, Phe, Tyr - peuvent établir soit un empilement π–π, soit des interactions hydrophobes, rendant les variants sensibles aux rocaglates49.

Les substitutions à la position 163 n'étaient pas uniformes d'une lignée à l'autre. Chez les protistes, 29 % des séquences avaient Tyr en position 163, suivi de Ser (15 %), Phe (14 %), Gly (14 %) et Val (12 %). Chez les champignons, la distribution était His (36%), Phe (24%), Gln (12%) et Ala (10%). Chez les plantes, 73% des séquences eIF4A avaient Phe en position 163 et 10% Tyr, tandis que chez les animaux, la proportion était de 51% Tyr et 34% Phe (tableau S2; Fig. S3).

Pour acquérir une compréhension évolutive de l'émergence de la résistance aux rocaglates, nous avons projeté les 365 séquences sur l'arbre de vie eucaryote (eToL) (Fig. 3)51. Sur les onze clades représentés, six, y compris des branches profondément enracinées telles que discoba (par exemple, Leishmania sp.) et metamonada (par exemple, Giardia sp.), contenaient des organismes résistants aux rocaglates.

Répartition de la résistance au rocaglate eIF4A sur l'eToL. Les cases vertes indiquent les clades représentés dans notre analyse eIF4A. Des variantes résistantes au rocaglate peuvent être trouvées dans des clades profondément enracinés ainsi que dans des clades plus récemment évolués. Plusieurs variantes sont exclusives à un clade tandis que d'autres sont distribuées plus généralement.

Seules les plantes du genre Aglaia, qui comme toutes les plantes supérieures sont apparues beaucoup plus tard dans l'évolution, produisent des rocaglates. Cette asynchronie dans l'émergence de la synthèse de rocaglate et de la résistance de eIF4A à celle-ci suggère que la «résistance au rocaglate» ne peut pas être motivée par l'exposition aux rocaglates mais être un résultat involontaire de la diversification de la séquence eIF4A. Une exception est l'Aglaia sp. champignon parasite Ophiocordyceps sp. BRM1, qui aurait pu développer une résistance par exposition directe41. À Aglaia, la résistance pourrait avoir émergé au fur et à mesure que la capacité de synthétiser les rocaglates évoluait. Le motif aa résistant au rocaglate de l'eIF4A d'Aglaia, TPLFQM, contient la substitution «résistante» la plus courante en position 163, Leu.

Nous avons découvert plusieurs organismes dont les isoformes eIF4A, eIF4A1 et eIF4A2, contiennent des motifs aa associés au rocaglate divergents (tableau S3). Parmi les protistes, il n'y avait pas de modèles divergents, sauf entre les deux isoformes eIF4A de Thecamonas trahens : l'archétype TPFFQI sensible au rocaglate et un modèle contenant trois substitutions, TPLFAV. Le L163 indique une résistance potentielle aux rocaglates, mais aucune confirmation in vitro ou in vivo n'existe. Parmi les champignons, cinq espèces appartenant à cinq genres différents ont présenté des isoformes divergentes. Toutes les isoformes ont basculé entre His et Ala en position 163, et dans quatre cas entre Ile et Val en position 199; la cinquième paire avait un Val à cette position. Trois espèces - Neurospora crassa, Purpureocillium lilacinum et Diplocarpon rosae - sont des agents pathogènes connus. L'effet de la substitution H163A sur la résistance n'est pas connu. Parmi les plantes, les six genres avec des modèles aa divergents présentaient plusieurs modèles de substitution. Trois paires d'isoformes ont basculé entre un Cys et un Phe en position 163 - nécessitant juste une mutation ponctuelle du deuxième nucléotide du codon correspondant de la guanine à l'uracile (UGC ou UGU à UUC ou UUU) - accompagnée d'un passage d'un Val à Ile en position 199. Une autre paire d'isoformes a basculé entre Ile et Val en position 199 mais a conservé le F163 dans les deux isoformes, et la microalgue Raphidocelis subcapitata avait des isoformes avec un motif de substitution unique : Y163N et L199C. Enfin, toutes les espèces d'Aglaia productrices de rocaglate présentaient une combinaison unique d'isoformes résistantes, TPLFQM et TPLFQI.

Les animaux présentaient le plus grand nombre d'isoformes divergentes de eIF4A. Sur 14 paires, 11 avaient probablement des substitutions neutres - F163Y et I199V - et cinq avaient une substitution F163L rendant l'une des isoformes résistantes. Tous les profils aa divergents avec une dichotomie résistant/sensible ont été trouvés chez les agents pathogènes - Trichuris trichiura, Schistocephalus solidus, Hymenolepis microstoma et Schistosoma mansoni.

Le chevauchement entre les résidus interagissant avec le rocaglate et l'ARN soulève la question de savoir comment des substitutions particulières pourraient affecter l'activité de l'hélicase à ARN de eIF4A. Il a été rapporté que des mutations uniques aux positions 159, 163 et 195 n'avaient aucun ou peu d'effet sur l'activité de l'hélicase à ARN39. Pour déterminer systématiquement l'effet des substitutions aa aux positions 163 et 199 sur l'activité de l'hélicase, nous avons généré 17 protéines eIF4A mutantes avec des substitutions simples et doubles dans un fond eIF4A1 humain (tableau S4). Cinq variantes contenaient des substitutions non naturelles pour tester les contraintes évolutives potentielles.

La comparaison des profils d'activité de l'hélicase à ARN a révélé une distribution étroite de Vmax entre les variantes (Fig. 4A). Les cinq modèles non naturels ont montré une plage de Vmax similaire aux modèles naturels. Trois des modèles de substitution naturelle - TPFFQV, TPYFQI et TPLFQM - ont présenté les activités d'hélicase les plus élevées. Parmi les motifs non naturels, un mutant dérivé de l'Aglaia sp. TPLFQM, TPHFQM, se sont démarqués pour présenter une Vmax plus similaire à celle des trois modèles naturels à Vmax élevée.

Activités d'hélicase d'ARN des protéines mutantes eIF4A contenant des modèles aa associés au rocaglate naturels et non naturels sélectionnés dans un contexte de protéines entières humaines. (A) Hélicase Vmax de l'eIF4A1 humain de type sauvage contenant le motif de liaison au rocaglate TPFFQI et 17 variantes de la protéine eIF4A1 humaine (tableau S4), dont une exprimant l'Aglaia sp. un modèle TPLFQM. Tous les modèles aa naturels et non naturels analysés présentaient Vmax dans une plage étroite, indiquant que l'activité de l'hélicase est maintenue. (B) Comparaison Vmax côte à côte de paires de mutants ne différant que par le résidu aa en position 199 de la protéine eIF4A. Les deux substitutions analysées, I199V et I199M, sont les seules substitutions naturelles à cette position révélées par notre enquête mondiale sur la séquence eIF4A (fluorescence relative RF ; les barres d'erreur indiquent l'erreur standard moyenne de trois répétitions techniques ; les barres d'erreur ont été supprimées en (B) pour plus de clarté) .

Deux substitutions naturelles en position 199 - I199V et I199M - ont montré un effet modulateur sur l'activité de l'hélicase (Fig. 4B). Le passage de Ile à Val augmente ou diminue Vmax en fonction de l'aa en position 163 ; le passage de Ile à Met a entraîné une amélioration équivalente du Vmax correspondant, quel que soit l'aa en position 163. La similitude de la taille de l'effet, de la directionnalité ou des deux, de ces mutations ponctuelles sélectionnées en position 199 sur le Vmax, et le le fait qu'il se situe dans la plage de Vmax naturelle déterminée pour les variants naturels de eIF4A, suggère que la tolérance de substitution est déterminée par l'efficacité de l'hélicase.

La tolérance aux substitutions en position 163 suggère que les résidus de diverses caractéristiques physicochimiques n'affectent pas sensiblement l'activité de l'hélicase. Toutes les variantes analysées ici ont été évaluées dans le même cadre de protéines humaines pour éliminer les facteurs de confusion structurels potentiels. En fin de compte, chacun des modèles devrait être évalué dans son échafaudage naturel pour déterminer le Vmax réel de chaque variante eIF4A.

Le serrage de l'ARNm à eIF4A nécessite des interactions d'empilement π – π, un processus contrôlé par des contraintes stériques dans la poche de liaison à l'ARNm. Les variants eIF4A contenant un Phe, Tyr ou His en position 163 facilitent l'empilement π – π et sont sensibles aux rocaglates, tandis que les variants avec des substitutions Leu ou Ser ne le font pas et sont résistants (tableau S2)38. Pour déterminer comment d'autres substitutions en position 163 affectent l'empilement π – π, nous avons mesuré les changements de température de dénaturation thermique de différents complexes eIF4A: ARN: rocaglate.

Nous avons analysé 18 variants naturels et non naturels choisis en fonction de la prévalence naturelle de substitutions aa particulières, par exemple Phe, Tyr, Leu ou His, et/ou de leur potentiel à établir des interactions d'empilement π–π, par exemple Trp (tableau S4). Pour évaluer l'effet des mutations en position 199, nous avons conçu les variantes pour alterner entre Ile, Val et Met.

Nous avons déterminé les déplacements de dénaturation thermique, la température de fusion Δ, pour les complexes eIF4A:ARN avec trois rocaglates : silvestrol, zotatifine et CR-1-31-B. Pour le silvestrol, des températures de fusion Δ plus élevées étaient corrélées à la sensibilité aux rocaglates (Fig. 5). Des déplacements de dénaturation thermique plus importants signifient des complexes eIF4A:ARN:rocaglate plus stables nécessitant des énergies de dissociation plus élevées. Les modèles présentant les plus grands changements de température étaient également les mieux représentés dans notre enquête (Fig. 5). Nous avons observé des schémas de décalage de dénaturation thermique équivalents pour la zotatifine et le CR-1-31-B (Fig. S4).

Les changements de température de dénaturation thermique de différents complexes eIF4A:ARN:silvestrol sont associés à la sensibilité de eIF4A aux rocaglates. Alors que les activités relatives de l'hélicase eIF4A des protéines mutantes eIF4A exprimant différents modèles aa de liaison au rocaglate se situent dans une plage étroite de valeurs Vmax et ne sont pas corrélées avec la sensibilité au rocaglate, l'analyse comparative du décalage thermique des protéines mutantes a montré une association claire entre la sensibilité aux rocaglates et une plus grande différentiels de dénaturation thermique entre les complexes eIF4A:ARN et eIF4A:ARN:silvestrol. La stabilité accrue des mutants sensibles au rocaglate est déterminée par les interactions d'empilement π – π provoquées par les résidus aa correspondants en position 163. Les points de données représentent les valeurs moyennes de trois répétitions techniques. Les erreurs standard pour les activités d'hélicase sont indiquées sur la figure 4A et les erreurs standard pour la température de fusion Δ sont répertoriées dans le tableau S5. La taille des cercles indique la prévalence du modèle aa parmi les eIF4A inclus dans notre enquête.

Toutes les mesures concernaient des variants aa simples ou doubles sur un échafaudage de protéine eIF4A1 humaine. Cette analyse a éliminé les facteurs de confusion structurels potentiels, mais a également anticipé une évaluation des substitutions dans leur contexte structurel naturellement évolué. Par exemple, la température de fusion Δ de l'eIF4A1 purifié d'Aedes aegypti (TPHFQV) avec du silvestrol était de 8,45 °C, supérieure aux 6,41 °C observées pour le variant eIF4A1 humain TPHFQI (tableau S6). Et un mutant H163L de l'Ae. aegypti eIF4A a présenté une réduction de 2,35 ℃ de la température de fusion Δ à 6,1 ℃, reflétant la tendance des changements de température de fusion observés pour les mêmes mutations aa 163 (F163H et F163L) dans l'échafaudage de la protéine eIF4A1 humaine (tableau S6). Ces résultats mettent en évidence la nécessité de déterminer la sensibilité de eIF4A aux roaglates dans leur contexte d'évolution naturelle afin de quantifier avec précision la sensibilité au rocaglate et l'activité de l'hélicase à ARN.

Pour évaluer si la sensibilité au rocaglate pouvait être prédite à partir de l'inférence in silico des énergies de liaison et des niveaux de contact intermoléculaire des complexes eIF4A:ARN:rocaglate, nous avons effectué une analyse d'amarrage des complexes eIF4A:ARN:rocaglate des 35 modèles avec silvestrol, zotatifine, et CR-1-31-B dans le contexte eIF4A1 humain38,52. Les deux paramètres étaient inversement corrélés, et les variants avec les énergies de liaison les plus faibles et les contacts intermoléculaires les plus élevés étaient les plus abondants dans notre enquête (Fig. S5). Les variants d'eIF4A qui étaient partagés avec un ou plusieurs autres clades ont convergé vers des variants à faible énergie de liaison/contact intermoléculaire élevé (Fig. S6).

L'analyse combinée des mesures de décalage de dénaturation thermique et des énergies de liaison déduites a fourni la séparation la plus forte entre les variantes sensibles et résistantes de eIF4A, et les contacts intermoléculaires et la sensibilité aux rocaglates étaient également associés (Fig. 6).

L'énergie de liaison combinée ou l'inférence de contact intermoléculaire avec l'analyse de la mesure du décalage de dénaturation thermique de certains complexes eIF4A:ARN:silvestrol révèle une forte association avec la sensibilité aux rocaglates. (A) La sensibilité aux rocaglates (bleu) était associée à des changements de dénaturation thermique élevés et à de faibles énergies de liaison, tandis que la résistance (rouge) était principalement associée à de basses températures de fusion. Le gris foncé désigne les variantes naturelles eIF4A1 de résistance non testée aux rocaglates ; le gris clair désigne les variantes eIF4A1 non naturelles. (B) La sensibilité aux rocaglates (bleu) était associée à des changements de dénaturation thermique élevés et à des contacts intermoléculaires élevés, tandis que la résistance (rouge) était principalement associée à de basses températures de fusion. Le gris foncé désigne les variantes naturelles eIF4A de résistance non testée aux rocaglates ; le gris clair désigne les variantes eIF4A non naturelles ; la ligne pointillée indique une séparation approximative entre les variantes sensibles et résistantes au rocaglate. Les points de données représentent les valeurs moyennes de trois répliques techniques (température de fusion Δ) et les valeurs uniques de l'analyse d'amarrage optimisée (contacts intermoléculaires). Les erreurs standard pour la température de fusion Δ sont répertoriées dans le tableau S5.

Des analyses analogues avec la zotatifine et le CR-1-31-B ont révélé un schéma potentiellement prédictif de sensibilité au rocaglate reflété dans quatre variantes sensibles connues - des changements de température de fusion et des énergies de liaison plus élevés pour le silvestrol et des valeurs pratiquement superposées pour la zotatifine et le CR-1-31-B (Fig. 7). Un autre variant de eIF4A, TPFFQV, qui n'a pas encore été évalué in vitro, présentait un schéma presque identique aux variants connus sensibles au rocaglate (Fig. 7).

Comparaison côte à côte des inférences d'énergie de liaison combinées et des mesures de décalage de dénaturation thermique pour le silvestrol, la zotatifine et le CR-1-31-B. Toutes les variantes eIF4A1 connues pour être sensibles aux rocaglates (bleu) présentaient des schémas remarquablement similaires pour les trois rocaglates. En revanche, les quatre variantes résistantes au rocaglate analysées ici (rouge) ont montré des modèles très disparates. Les quatre variantes pour lesquelles aucune détermination expérimentale de la sensibilité aux rocaglates n'existe (gris foncé), ont montré deux modèles distincts, l'un qui était analogue à celui des modèles sensibles analysés ici, et trois qui étaient analogues entre eux et différents de tous les autres modèles sensibles ou motifs résistants.

La modélisation informatique basée sur la structure a révélé que le silvestrol peut également interagir avec les résidus Arg à proximité à la surface de eIF4A - Arg110, Arg282 et Arg311 - via sa fraction 1,4-dioxane (Fig. S7). Ces résidus Arg appartiennent à des motifs structurellement distincts et conservés de eIF4A : Arg110 fait partie de la séquence PTRELA du motif Ia, Arg282 fait partie de la séquence VIFCNTR du motif IV et Arg311 fait partie du motif QxxR. Ces trois motifs se replient dans une « poche Arg » conservée adjacente à la poche de liaison à l'ARN42. Arg311 est également impliqué dans la formation d'un pont salin critique vers les groupes phosphate de l'ARN38,53.

Des études de mutagenèse de la poche Arg ont montré que des substitutions simples et triples de ces résidus à Ala entraînent une réduction de la capacité de l'ARN à former un complexe avec eIF4A, entraînant divers degrés de serrage avec silvestrol, RocA et CR-1-31-B (Tableau S6). La mutation R282A a réduit de moitié le changement de température et la mutation R110A n'a entraîné aucun changement de température. Aucun ajout d'ARN aux tests n'a entraîné une déstabilisation constante de l'association eIF4A d'environ -3,32 ℃ (SD ± 0,53) (tableau S6), indiquant une capacité réduite de l'ARN à se lier aux mutants R110A et R282A. Le R311A et les triples mutants présentaient des décalages de température négatifs équivalents à ceux observés dans tous les tests de contrôle sans addition d'ARN, indiquant une incapacité des protéines eIF4A mutées à se lier à l'ARN (Fig. S8).

Les variants eIF4A résistants au rocaglate - TPLFQI, TPIFQI, TPHFQI et TPLFQM - n'ont montré aucun schéma de liaison relatif clair pour les trois rocaglates que nous avons testés (Fig. 7). Les valeurs extrêmes des valeurs déterminées expérimentalement et in silico pour la variante TPLFQM, y compris son hélicase d'ARN optimale Vmax, indiquent que cette variante est évolutivement favorisée dans le contexte d'Aglaia sp.

Les autres variants naturels d'eIF4A de sensibilité inconnue que nous avons analysés - TPVFQI, TPQFQI et TPEFQI - présentaient des schémas analogues entre eux, avec des énergies de liaison plus faibles pour le silvestrol que pour la zotatifine et le CR-1-31-B, et des températures de fusion systématiquement plus élevées pour la zotatifine que pour silvestrol ou CR-1-31-B (Fig. 7). Sur la base des énergies de liaison et des contacts intermoléculaires déduits de l'analyse d'amarrage, le résidu Val en position 163 pourrait médier le serrage déclenché par le rocaglate via des interactions hydrophobes entre le cycle phényle C des rocaglates et la chaîne aliphatique de Val, ce qui rend ce modèle sensible aux rocaglates ( figure 8). Le squelette carboné de Val est plus court que ceux de Leu et Ile, qui ont tous deux empêché la formation d'interactions hydrophobes ou d'empilement π – π et n'ont pas permis au silvestrol d'interagir avec eIF4A dans notre analyse d'amarrage (Fig. 8). L'analyse d'amarrage a prédit qu'un résidu Val en position 163 pourrait favoriser l'établissement d'interactions hydrophobes stables avec les rocaglates.

Amarrage moléculaire du silvestrol pour sélectionner les variants eIF4A. (A) Les résidus aa aromatiques ou de type aromatique en position 163 tels que Phe ou His, respectivement, permettent l'établissement d'interactions stables d'empilement π – π avec les rocaglates. (B) Les substitutions avec des résidus aa à chaîne courte tels que Val permettent des interactions hydrophobes avec les rocaglates qui peuvent dans une certaine mesure compenser l'absence d'interactions d'empilement π – π. (C) De longues chaînes latérales aliphatiques telles que Leu ou Ile préviennent stériquement la formation d'interactions hydrophobes stables, rendant les eIF4A correspondants résistants au serrage médié par le rocaglate du complexe eIF4A:ARN.

L'analyse d'amarrage des mutants TPQFQI et TPEFQI a prédit la formation d'interactions hydrophobes stables avec les rocaglates dans des conformations analogues à l'empilement π – π observé avec Phe et Tyr ou l'aa His basique de type aromatique en position 163 (Fig. 8). Malgré leur nature chimique différente, Gln, un résidu amine, et Glu, un résidu acide, présentaient des énergies de liaison et des modèles de décalage de dénaturation thermique similaires vis-à-vis du silvestrol, de la zotatifine et du CR-1-31-B. Cette similarité, qui implique l'établissement d'interactions hydrophobes stables, pourrait être induite par les longs squelettes carbonés de Gln et Glu.

Nous avons effectué des tests de sensibilité au silvestrol in vitro avec quatre espèces exprimant des eIF4A avec des profils aa non testés auparavant, quatre espèces avec des profils aa précédemment testés mais appartenant à de nouveaux genres, et une espèce appartenant à un genre qui avait été précédemment caractérisé comme sensible au rocaglate mais n'avait pas été contesté avec silvestrol (tableau 1).

Nous avons sélectionné deux agents pathogènes - Toxoplasma gondii et Trypanosoma brucei brucei - le vecteur pathogène Aedes aegypti et le nématode non pathogène Caenorhabditis elegans pour tester si nos prédictions sur la sensibilité à eIF4A pouvaient être confirmées. Aé. aegypti, T. gondii et T. brucei brucei devaient être sensibles au silvestrol sur la base de leurs substitutions aa : F163H (Ae. aegypti, T. gondii) et F163V (T. brucei brucei), et C. elegans devait être résistant au silvestrol (F163G). En effet, en utilisant des tests de viabilité, de développement ou de durée de vie spécifiques au modèle, nous avons pu confirmer les trois prédictions (Figs. S9 et S10).

Nous avons complété la série en testant un autre agent pathogène important, Schistosoma mansoni, et les mouches des fruits non pathogènes Anastrepha suspensa et Drosophila melanogaster. Les séquences eIF4A de S. mansoni et D. melanogaster contenaient respectivement les motifs aa TPFFQI et TPYFQV, qui s'étaient précédemment révélés sensibles aux rocaglates. La séquence eIF4A d'A. suspensa n'était pas disponible au moment de la rédaction de cet article, mais la séquence d'ARNm eIF4A de l'A. fraterculus étroitement apparenté était disponible (TPYFQV)54 et, étant donné le consensus à 100 % de ce motif dans cinq genres et 32 espèces de mouches des fruits (tableau S2), nous avons supposé la présence du même motif chez A. suspensa. Avec ces tests, nous avons pu confirmer l'applicabilité des résultats de sensibilité d'une espèce à des genres non apparentés. En plus de T. brucei, nous avons également testé deux autres agents pathogènes protozoaires - Leishmania amazonensis et Plasmodium falciparum - pour confirmer que les profils aa associés à la sensibilité au silvestrol chez une espèce conféreraient une sensibilité à différentes espèces du même genre contenant le même profil aa. Nous avons également observé que deux protozoaires d'une même famille, T. brucei et L. amazonensis - ont présenté une sensibilité et une résistance au rocaglate, respectivement, en concordance avec leurs profils eIF4A aa correspondants (Figs. S10 et S11 ; Tableau 1).

Tous les tests ont confirmé les prédictions, augmentant le nombre d'agents pathogènes potentiels qui peuvent désormais être ciblés avec les rocaglates des 50 % que nous avions initialement estimés sur la base des rapports de sensibilité connus à 60 % (tableau S2). La proportion d'agents pathogènes potentiellement résistants est passée de 13 à 19 % (tableau S2).

L'analyse combinée de l'énergie de liaison et du décalage de dénaturation thermique a montré des schémas analogues pour trois variantes de sensibilité inconnue aux rocaglates : TPVFQI, TPEFQI et TPQFQI (Fig. 7). Les résultats in vitro révélant la sensibilité du TPVFQI au silvestrol suggèrent que les organismes contenant la combinaison analogue aa TPEFQI et TPQFQI pourraient également être sensibles aux rocaglates, élargissant encore la liste des agents pathogènes et autres organismes nuisibles pouvant être ciblés avec les roaglates (tableau S2).

Les six résidus aa qui déterminent la sensibilité de eIF4A aux rocaglates fournissent un outil pour prédire la sensibilité. Notre analyse de mutants fournit la première confirmation in vitro de trois prédictions : TPVFQI et TPHFQV (sensible) et TPGFQV (résistant).

TPVFQI, présent dans Trypanosoma sp., ouvre la possibilité de cibler T. brucei (maladie du sommeil) et T. cruzi (maladie de Chagas). Le TPHFQV est présent dans les agents pathogènes agricoles, notamment Cystoisospora suis et Marssonina coronariae, et dans les vecteurs de maladies à fort impact Aedes aegypti et Ae. albopictus. Le TPGFQV, qui, à l'exception de Caenorhabditis elegans, ne se trouve que chez les protistes, exclut l'utilisation de rocaglates ou de ses dérivés pour les agents pathogènes, notamment Phytophthora sp., Aphanomyces sp. et Saprolegnia sp. La variante résistante analogue TPGFQI n'a jusqu'à présent été identifiée que chez Aglaia sp. parasite fongique Ophiocordyceps sp..

La sensibilité pourrait être prédite par modélisation in silico des énergies de liaison et des niveaux de contact intermoléculaires du complexe ternaire eIF4A:ARN:rocaglate et par analyse in vitro des températures de fusion des complexes eIF4A:ARN. Notre analyse montre le potentiel d'enrôlement des rocaglates pour lutter contre les agents pathogènes, mais plusieurs questions importantes demeurent.

Premièrement, la diversité des variantes d'eIF4A que nous rapportons pourrait ne représenter qu'une fraction de leur véritable diversité naturelle, mais elle donne un aperçu des contraintes évolutives potentielles déterminant la résistance aux rocaglates qui pourraient être essentielles pour anticiper l'émergence d'une résistance supplémentaire.

Deuxièmement, notre analyse a montré l'effet de substitutions aa simples sur la dynamique intermoléculaire dans un contexte humain fixe, mais la façon dont ces variantes se comportent dans leurs échafaudages protéiques naturels devra finalement être déterminée dans leurs échafaudages natifs.

Et troisièmement, l'interaction de différents rocaglates avec eIF4A varie de manière subtile qui n'est pas encore complètement comprise. Par exemple, le variant TPIFQI provoque des interactions analogues avec le silvestrol et le CR-1-31-B qui sont distinctes de celles avec la zotatifine et ne peuvent donc pas être expliquées uniquement par la présence du fragment 1,4-dioxane du silvestrol. La compréhension de ces interactions naturelles éclairera davantage la conception de rocaglates d'une efficacité et d'une spécificité améliorées.

La cartographie des variantes eIF4A sur l'arbre de vie eucaryote - un proxy largement accepté pour une chronologie évolutive - a révélé une distribution aléatoire des variantes de résistance. Étant donné que la biosynthèse connue des rocaglates est limitée à un genre végétal, Aglaia, qui aurait émergé à un stade beaucoup plus tardif que la plupart des organismes résistants que nous avons identifiés, et qu'un rôle fonctionnel des rocaglates chez Aglaia sp. n'est pas connue, deux scénarios d'émergence de la résistance au rocaglate peuvent être explorés.

Premièrement, une résistance pourrait émerger suite à une exposition au rocaglate biosynthétisé par Aglaia. La description récente d'Aglaia sp. champignon parasite Ophiocordyceps sp. BRM1 prend en charge un tel scénario. Cependant, de nombreux autres organismes résistants aux rocaglates ont des distributions qui ne se chevauchent pas avec celle d'Aglaia, ou des distributions mondiales, ce qui rend peu probable que les roaglates aient fourni une pression évolutive.

Alternativement, la résistance au rocaglate pourrait être un sous-produit neutre de la variation naturelle de eIF4A. Cela serait étayé par le fait que la Vmax relative des différentes variantes naturelles d'eIF4A que nous avons analysées était remarquablement constante, et qu'Aglaia sp. et Ophiocordyceps sp. BRM1 sont les seuls organismes dans lesquels les deux isoformes eIF4A sont résistantes aux rocaglates, les protégeant respectivement de l'auto-empoisonnement et de l'empoisonnement par l'hôte.

Aucun de ces scénarios ne peut être exclu car une tolérance de substitution pourrait être à l'origine de l'apparition aléatoire de variants «résistants», et la proximité physique et l'exposition aux rocaglates pourraient simultanément déclencher le maintien de variants «résistants».

Nous avons identifié des cibles potentielles pour les rocaglates sur la base des séquences eIF4A d'agents pathogènes d'intérêt pour la santé humaine, animale et végétale. Les données mettent également en évidence le potentiel de développement de novo de la résistance au rocaglate et la nécessité de gérer avec soin toute application anti-pathogène de rocaglate.

Le déploiement des antimicrobiens nous a appris que la nature s'adaptera toujours aux nouveaux défis grâce à l'évolution naturelle et à la survie du plus apte55. Cela a entraîné l'émergence d'une résistance aux antimicrobiens, que ce soit par transfert latéral de gènes d'autres micro-organismes, mutations de novo ou réorientation des mécanismes existants de détoxification.

L'émergence de la résistance aux pesticides dans des organismes plus complexes tels que les champignons et les insectes a été liée à des facteurs tels que le nombre de mutations ponctuelles nécessaires à la résistance, la préexistence d'allèles de résistance dans une population et l'aptitude des variants résistants mutés dans l'absence de la pression de sélection correspondante56,57.eIF4A la résistance aux rocaglates pourrait être un trait accidentel résultant de la tolérabilité de la substitution aa en position 163. Des mutations ponctuelles conduisant à des changements aa à cette position peuvent transformer un organisme sensible au rocaglate en un organisme résistant . Le serrage induit par Rocaglate est principalement déterminé par le résidu aa en position 163, cependant, cela se produit dans les contraintes de quatre autres résidus devant rester inchangés - 158, 159, 192 et 195 - et un étant tolérant à une substitution minimale - 199. Le serrage nécessite également la présence de deux bases d'ARN purine adjacentes pour stabiliser le complexe eIF4A1: ARN, ce qui limite la tolérabilité des substitutions au niveau de l'ARN pertinent interagissant avec les résidus aa de eIF4A40. La combinaison de ces facteurs fait de l'émergence de la résistance un événement évolutif plus complexe quoique globalement encore peu barrière.

A priori, la diversité naturelle des allèles eIF4A résistants au rocaglate semble constituer un frein majeur à la mise en place de stratégies anti-pathogènes à base de rocaglate. Cependant, ce vaste catalogue d'informations sur la séquence, les facteurs structurels et physicochimiques qui caractérisent les allèles «résistants» pourrait être utilisé pour éclairer le développement de nouveaux composés, le déploiement de programmes de contrôle soigneusement gérés et la surveillance de l'émergence d'une résistance potentielle de novo. dans les populations gérées.

Le «sauvetage de la condition physique» chez les espèces contenant une isoforme résistante et une isoforme sensible n'a jusqu'à présent été démontré que dans les cas où eIF4A1 est l'isoforme résistante, mais pas lorsque c'est eIF4A2 qui contient l'allèle résistant. C'est le cas de la plupart des agents pathogènes que nous avons analysés jusqu'à présent. Et bien que nous n'ayons aucun moyen de savoir à quelle vitesse les mutations résistantes ont été acquises sur des échelles de temps évolutives, notre analyse a révélé que, du moins en théorie, des mutations résistantes pourraient survenir rapidement par le biais d'événements de mutation ponctuelle à la position d'oscillation du codon, comme en témoigne le passage de Phe à Leu.

Toutes les variantes naturelles d'eIF4A présentent une Vmax relative dans une plage étroite qui est très probablement essentielle à la forme physique de l'organisme. Cela s'applique à la fois aux variantes résistantes et sensibles d'eIF4A, ce qui suggère que l'aptitude ne serait pas un facteur décisif pour l'établissement permanent d'un allèle résistant.

Compte tenu du nombre minimal de substitutions aa nécessaires à la résistance, de la préexistence d'allèles de résistance dans la population et de l'avantage de fitness neutre des variants résistants en l'absence de rocaglates, l'opportunité d'utiliser les rocaglates comme anti-pathogènes est complexe. Bien que les facteurs énumérés semblent compromettre le potentiel d'exploitation des rocaglates pour la gestion des agents pathogènes, ces connaissances, qui faisaient souvent défaut avant la mise en œuvre d'autres composés anti-pathogènes, pourraient fournir la base de stratégies plus robustes et plus solides. Des mesures telles que des déploiements ponctuels et à forte concentration de rocaglates accompagnés de programmes de surveillance complets pourraient être une approche pour minimiser l'émergence de la résistance. Tirer parti des fenêtres thérapeutiques favorables du rocaglate chez l'homme et l'animal, par rapport à la sensibilité des champignons et des protistes, pourrait être essentiel pour développer des interventions sûres contre certains parasites sensibles au rocaglate. L'exploitation du catalogue complet de variantes naturelles d'eIF4A découvertes dans notre étude pourrait encore aider à faire avancer la recherche de nouveaux rocaglates synthétiques ou d'autres inhibiteurs de petites molécules de spécificité et d'efficacité améliorées.

L'analyse de la séquence a été effectuée à l'aide des séquences complètes de la protéine eIF4A extraites de Genbank et en les validant de manière croisée sur UniProt pour déterminer des isoformes spécifiques. Seules les séquences correspondant aux isoformes eIF4A1 et eIF4A2 ont été utilisées pour l'analyse. Ensuite, nous avons extrait les six motifs d'acides aminés associés à la liaison du rocaglate pour chacune des séquences protéiques (positions humaines 158, 159, 163, 192, 195, 199)38,39. Des distributions de motifs variants ont été déterminées au sein de chaque groupe eucaryote et cartographiées sur la dernière version de l'arbre de vie eucaryote51. Les logos de séquence illustrant les tolérances des acides aminés pour les six acides aminés analysés ont été rendus à l'aide de Seq2Logo-2.050.

Des variants eIF4A sélectionnés avec des substitutions simples et doubles aux positions 163 et/ou 199 ont été générés à l'aide de la mutagenèse dirigée par PCR d'un plasmide codant pour eIF4A1 humain (pET-28a( +)_eIF4A1(19-406) contenant un His N-terminal -Tag et un site de clivage de la thrombine ; amorces spécifiques de la variante répertoriées dans le tableau S4). Des doubles mutants ont été générés en générant d'abord les mutations en position 163 suivies des mutations en position 199. Les produits de ligation ont été transformés dans des cellules E. coli DH5a et les plasmides ont été séquencés pour confirmer les substitutions correspondantes. Après confirmation de la séquence, des cellules E. coli BL21 (DE3) compétentes ont été transformées avec les plasmides et cultivées dans un milieu de bouillon de lysogénie à 37 ° C jusqu'à OD600 ~ 0,5. Après l'ajout d'IPTG 0,5 mM, les cellules ont été cultivées à 15 ° C pendant 16 h. Les cellules collectées ont été lysées par sonication dans un tampon HEPES-KOH 20 mM (pH 7,5, KCl 300 mM, imidazole 20 mM, β-mercaptoéthanol 5 mM, EDTA 0,1 mM, 10 % (v/v) glycérol) avec 1× cOmplete ™, Mini, Cocktail Inhibiteur de Protéase sans EDTA (Roche). Le lysat a été fractionné sur une colonne HisTrap™ HP 1 ml (GE Healthcare) en utilisant un gradient linéaire du tampon de sonication au tampon d'élution (tampon de sonication avec 250 mM d'imidazole). Les fractions culminées ont été collectées, échangées contre un tampon HEPES-KOH 20 mM (pH 7,5, KCl 300 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM et 10 % (v/v) glycérol), surgelées dans de l'azote liquide et stocké à –80 °C.

Les activités d'hélicase des variants eIF4A ont été déterminées à l'aide d'un test basé sur la fluorescence. La capacité à dérouler les substrats dsRNA a été mesurée à l'aide de deux substrats d'ARN marqués : un 10mer modifié avec Cyanine 3 (10mer-Cy3 ; 5′-[CY3]GCUUUCCGGU-3′), et un 16mer modifié avec Black Hole Quencher 2 (16mer-BHQ2 ; 5'-ACUAGCACCGGAAAGC[BHQ2]-3'). Un compétiteur non marqué (compétiteur 10mer; 5′-GCUUUCCGGU-3′) a été utilisé pour capturer l'ARN extincteur libéré. Un substrat d'ARN Cy3 simple brin (ssRNA) a été utilisé pour déterminer le signal de fluorescence maximal de la réaction. Des quantités équimolaires de 10mer-Cy3 et 16mer-BHQ2 ont été recuites à 80 ° C pendant 5 min et incubées à température ambiante pendant 1 h, suivies d'une incubation sur glace pendant 10 min dans un HEPES 25 mM (pH 7, 4 (KOH) dans ddH2O). L'ARN concurrent a été ajouté en excès de 1:10 (v/v) aux substrats d'ARN marqués et la réaction a de nouveau été incubée sur de la glace pendant 10 min avant de l'ajouter au mélange réactionnel d'hélicase. eIF4A (concentration finale de 25 µM) a été ajouté à la réaction et la fluorescence a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques Safire 2 (Tecan).

Des essais de décalage thermique ont été réalisés en incubant 5 μM d'eIF4AI humain recombinant (19-406) avec 50 μM d'un ARN polypurique (AG)5 (Biomers, Ulm, Allemagne), 1 mM AMP-PNP (Roche, Bâle, Suisse), 100 μM de rocaglate (silvestrol, RocA, zotatifine ou CR-1-31-B) et 75 μM SYPRO Orange (S6650, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dans un tampon HEPES-KOH 20 mM (pH 7,5, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA et 10 % (v/v) glycérol) pendant 10 min à température ambiante. Les courbes de fusion ont été mesurées entre 10 et 95 ℃ à une vitesse de rampe de 1,6 ℃/min en utilisant le système PCR en temps réel QuantStudio3™ (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) dans une plaque MicroAmp™ Fast Optical 96 puits (Applied Biosystems , Waltham, MA, États-Unis).

L'amarrage moléculaire a été effectué à l'aide d'AutoDock, v4.258. Les protéines ont été traitées en ajoutant tous les atomes d'hydrogène et en fusionnant des atomes d'hydrogène non polaires à l'aide d'AutoDock Tools 1.5.7. Les charges ont été attribuées en utilisant la méthode Gasteiger avec des torsions fixes pour le ligand. Nous avons défini une boîte de grille de 60 × 60 × 60, 3, 75 Å autour des sites actifs avec des dimensions x, y et z de 46, 355, 9, 919, 47, 473, respectivement. La boîte de grille rigide a été définie à l'aide d'AutoGrid 4, suivie d'AutoDock avec l'algorithme génétique lamarckien pour obtenir les meilleures poses d'amarrage59. Les amarrages ont été effectués en double et l'énergie de liaison moyenne rapportée. Certaines poses représentant des affinités de liaison optimales ont été visualisées à l'aide de l'UCSF Chimera (Université de Californie).

Des tests de prolifération cellulaire ont été effectués avec des lignées cellulaires d'insectes (Aag2 [A. aegypti]60, AsE01 [A. suspensa]61 et S2 [D. melanogaster] (ThermoFisher)) en utilisant le test WST-1 (Sigma-Aldrich). Les cellules (Aag2 : 1,2 × 105 cellules/100 μL, AsE01 : 1 × 105 cellules/100 μL, S2 : 6 × 104 cellules/100 μL) ont été incubées en présence de silvestrol (0 nM à 1,6 μM). Après une incubation de 24 h avec du silvestrol, nous avons ajouté le réactif WST-1 tel que spécifié par le fabricant et avons attendu trois heures supplémentaires avant de déterminer la mortalité cellulaire en mesurant l'absorbance à 440 nm (longueur d'onde de référence : 600 nm). Les valeurs CC50 ont été déterminées pour chaque ensemble de réplicats biologiques mesurés (GraphPad Prism V9).

L'effet du traitement au silvestrol sur la réplication de Toxoplasma gondii dans les cellules MARC-145 [Elabscience] a été déterminé 48 h après l'infection (h pi). La viabilité cellulaire a été contrôlée après 48 h de traitement avec jusqu'à 100 nM de silvestrol via des tests XTT (solvant : DMSO (1 : 500) ; contrôle positif : traitement Triton X-100 (1 : 200) ; contrôle négatif : milieu ordinaire). A 48 h pi, le nombre de tachyzoïtes de T. gondii libérés des cellules hôtes infectées dans le surnageant cellulaire a été déterminé. Les dosages ont été effectués en triple.

Des tests de viabilité de T. brucei brucei (souche 427 non recombinante) ont été effectués pendant 48 h en utilisant du milieu HMI-9 (DMEM modifié (IMDM ; Cell Gro) ; 10 % FBS ; 10 %, sérum plus (SAFC) ; 0,05 mM Bathocuproinesulfonate ; 1,5 mM de l-cystéine ; 1 mM d'hypoxanthine ; 0,2 mM de β-mercaptoéthanol ; 0,16 mM de thymidine ; 1 mM de pyruvate). Après une incubation de 48 h, les cellules ont été marquées au bleu Alamar et la fluorescence mesurée à 530 nm et 590 nm. Tous les tests ont été effectués en triple.

Des essais de développement et de durée de vie ont été effectués avec des vers C. elegans de type sauvage N2 élevés sur des plaques d'agarose NGM infusées de silvestrol et ensemencées avec 30 µl de milieu OP50 E. coli/LB. Pour les tests de développement, dix vers ont été autorisés à pondre des œufs pendant 2 h (synchronisation), des œufs uniques ont été isolés sur des plaques expérimentales séparées et incubés à 20 ℃, et le premier événement de ponte après 59 h a été déterminé. Le nombre de descendants a été déterminé en comptant le nombre total de descendants d'animaux synchronisés et isolés62. Pour les tests de durée de vie, 40 vers ont été autorisés à pondre des œufs pendant 2 h (synchronisation), 15 œufs par plaque ont été transférés dans des plaques expérimentales et incubés à 20 ℃, et après 3 jours, les mères ont été transférées dans une plaque fraîche tous les deux jours jusqu'à ce que huitième jour de l'âge adulte pour éviter la prolifération par la progéniture. Les vers vivants ont été comptés quotidiennement jusqu'à ce qu'ils meurent tous. Les décès non naturels ont été retirés de l'analyse. Tous les tests ont été effectués au moins en triple.

Des couples de vers adultes ont été cultivés dans du milieu M199 (Sigma-Aldrich, Allemagne) additionné de 10 % de sérum de veau nouveau-né, 1 % d'HEPES 1 M et 1 % de solution ABAM (10 000 unités/ml de pénicilline, 10 mg/ml de streptomycine et 25 mg/ml amphotéricine B) à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2. L'activité du silvestrol (100 et 200 nM) contre les vers a été évaluée pendant sept jours in vitro. Le milieu et le silvestrol ont été rafraîchis quotidiennement et la motilité des vers ainsi que le nombre d'œufs pondus ont été évalués après trois et sept jours à l'aide d'un microscope inversé (Labovert, Allemagne). La motilité des vers a été notée comme recommandé par l'OMS-TDR63, où un score de '3' indique une motilité normale, '2' une motilité réduite, '1' des mouvements minimes et sporadiques et '0' représente des vers morts (aucun mouvement dans les 30 s) . Les vers ont été obtenus à partir de hamsters infectés, comme décrit ailleurs64.

Toutes les expérimentations animales avec des hamsters syriens (Mesocricetus auratus) ont été menées conformément à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques (STE n° 123 ; annexe A révisée), ont été approuvées par le Conseil régional (Regierungspräsidium) Giessen, Allemagne (V54-19 c 20/15 h 02 GI 18/10 Nr. A 14/2017), et sont signalés conformément aux directives ARRIVE.

Des promastigotes d'une souche de L. amazonensis exprimant la β-lactamase65 ont été cultivés dans des cellules macrophages J774 immortalisées [ATCC] cultivées dans du RPMI additionné de 10 % de FBS et de 1 % de PSG. En bref, des essais en double avec du silvestrol et des contrôles en triple ont été effectués avec des macrophages en plaque infectés par L. amazonensis en phase stationnaire (25 parasites/macrophage) et incubés pendant une nuit à 32 ° C et 5 % de CO2. Des dilutions en série de silvestrol ont été ajoutées et incubées pendant 96 h à 32 °C et 5 % de CO2. Les tests de viabilité ont été effectués à l'aide du substrat β-lactamase CENTA™ (EMD Chemicals) et du Nonidet P-40 (Igepal CA 360, Fluka), et l'absorbance a été mesurée à 405 nm.

Des tests de viabilité basés sur la fluorescence ont été effectués pendant 96 h avec des cultures asexuées érythrocytaires (5 % d'hématocrite) de la souche 3D7 de P. falciparum (0,25 % de parasitémie au stade anneau ; synchrone) dans du milieu RPMI (RPMI 1640 ; 25 mM HEPES ; 10 ug/ml de gentamycine ; Hypoxanthine 0,5 mM ; pH 6,75 ; bicarbonate de sodium 25 mM ; Albumax II 0,5 % ; 1 % O2, 5 % CO2 : 94 % N2)66. La viabilité a été déterminée en quantifiant la fluorescence après coloration des cellules de P. falciparum avec SYBR Green I (Molecular Probes).

Toutes les données de séquence analysées dans cette étude ont été extraites de Genbank. Les deux nouvelles séquences correspondant à Aglaia stellatopilosa et à Aglaia glabriflora ont été déposées dans Genbank (Numéros d'adhésion ON844099 [Aglaia Stellatopilosa GORI facteur d'initiation aryotique 4a isoforme 1 (eIF4A) ARNm, CD partiel], respectivement). Toutes les autres données présentées dans cette étude sont rapportées dans leur intégralité dans les tableaux supplémentaires.

Baragaña, B. et al. Un nouvel agent antipaludique en plusieurs étapes qui inhibe la synthèse des protéines. Nature 522(7556), 315–320. https://doi.org/10.1038/nature14451 (2015) (erratum dans : Nature. 2016 Sep 1;537(7618):122).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cestari, I. & Stuart, K. Inhibition de l'isoleucyl-ARNt synthétase comme traitement potentiel de la trypanosomose humaine africaine. J Biol Chem. 288(20), 14256–14263. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.447441 (2013) (epub 2013 2 avril).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iyer, KR et al. L'inhibition de la traduction par les rocaglates active un programme de mort cellulaire spécifique à l'espèce chez l'agent pathogène fongique émergent Candida auris. MBio 11(2), e03329-e3419. https://doi.org/10.1128/mBio.03329-19 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, Z. et al. Les tirandamycines de Streptomyces sp. 17944 inhibant l'ARNt synthétase de l'asparagine du parasite Brugia malayi. Org. Lett. 13(8), 2034-2037. https://doi.org/10.1021/ol200420u (2011) (epub 15 mars 2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shah, P., Ding, Y., Niemczyk, M., Kudla, G. & Plotkin, JB Étapes limitant le débit dans la traduction des protéines de levure. Cellule 153(7), 1589-1601. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.049 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weinberg, DE et al. L'amélioration des mesures de l'empreinte ribosomale et de l'ARNm donne un aperçu de la dynamique et de la régulation de la traduction de la levure. Cell Rep. 14(7), 1787–1799. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.01.043 (2016) (epub 11 février 2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu, J. & Pelletier, J. Opportunités thérapeutiques en traduction eucaryote. Cold Spring Harb. Perspective. Biol. 10(6), a032995. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a032995 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kapp, LD & Lorsch, JR La mécanique moléculaire de la traduction eucaryote. Annu. tour. Biochimie. 73, 657–704. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.73.030403.080419 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hinnebusch, AG Aperçus structurels du mécanisme de balayage et de démarrage de la reconnaissance des codons dans l'initiation de la traduction eucaryote. Tendances Biochem. Sci. 42(8), 589–611. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2017.03.004 (2017) (epub 2017 avril 22).

Article CAS PubMed Google Scholar

Andreou , AZ & Klostermeier , D. L'hélicase DEAD-box eIF4A : Paradigme ou l'intrus ?. ARN Biol. 10(1), 19–3 https://doi.org/10.4161/rna.21966 (2013) (epub 2012 Sep 20).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xue, C., Gu, X., Li, G., Bao, Z. & Li, L. Expression et rôles fonctionnels des protéines eucaryotes de la famille du facteur d'initiation 4A dans les cancers humains. Devant. Cellule Dév. Biol. 9, 711965. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.711965 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams-Hill, DM, Duncan, RF, Nielsen, PJ & Tahara, SM L'expression différentielle des isogènes du facteur d'initiation de la traduction eucaryote murin eIF4A(I) et eIF4A(II) dépend de l'état de croissance cellulaire. Cambre. Biochimie. Biophys. 338(1), 111–120. https://doi.org/10.1006/abbi.1996.9804 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Naineni, SK et al. Une étude comparative de petites molécules ciblant eIF4A. ARN 26(5), 541–549. https://doi.org/10.1261/rna.072884.119 (2020) (epub 2020 3 février).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shen, L. & Pelletier, J. Ciblage sélectif du facteur d'initiation eucaryote de l'hélicase à ARN à boîte DEAD (eIF) 4A par des produits naturels. Nat. Prod. Rep. 37(5), 609–616. https://doi.org/10.1039/c9np00052f (2020) (epub 2019 nov. 29).

Article CAS PubMed Google Scholar

King, ML et al. Structure cristalline aux rayons X du rocaglamide, un nouveau 1H-cyclopenta[b]benzofurane antileulémique d'Aglaia elliptifolia. J. Chem. Soc. Chim. Commun. 1982, X101–X102 (1995).

Google Scholar

Hwang, BY et al. Silvestrol et episilvestrol, dérivés anticancéreux potentiels du rocaglate d'Aglaia silvestris. J. Org. Chim. 69(10), 3350–3358. https://doi.org/10.1021/jo040120f (2004) (erratum dans : J Org Chem. 2004 Sep 3 ;69(18):6156).

Article CAS PubMed Google Scholar

Greger, H. Phytochimie comparative des flavaglines (= rocaglamides), un groupe de flavolignans hautement bioactifs des espèces Aglaia (Meliaceae). Phytochem. Rév. 21(3), 725–764. https://doi.org/10.1007/s11101-021-09761-5 (2022) (epub 2021 juin 4).

Article CAS PubMed Google Scholar

Harneti, D. & Supratman, U. Phytochimie et activités biologiques des espèces d'Aglaia. Phytochimie 181, 112540. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2020.112540 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Svitkin, YV et al. L'exigence du facteur d'initiation eucaryote 4A (elF4A) dans la traduction est directement proportionnelle au degré de structure secondaire 5' de l'ARNm. ARN 7(3), 382–394. https://doi.org/10.1017/s135583820100108x (2001).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wolfe, AL et al. Les quadruplexes G d'ARN provoquent la traduction de l'oncogène eIF4A-dépendante dans le cancer. Nature 513(7516), 65–70. https://doi.org/10.1038/nature13485 (2014) (epub 2014 juil. 27).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Toribio, R., Diaz-Lopez, I. & Ventoso, I. Nouvelles perspectives sur la topologie du ribosome à balayage lors de l'initiation de la traduction : Leçons tirées des virus. ARN Biol. 13(12), 1223–1227. https://doi.org/10.1080/15476286.2016.1247146 (2016) (epub 2016 8 novembre).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Waldron, JA et al. Les éléments structuraux de l'ARNm immédiatement en amont du codon d'initiation dictent la dépendance vis-à-vis de l'activité de l'hélicase eIF4A. Génome Biol. 20(1), 300. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1901-2 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mauger, DM et al. La structure de l'ARNm régule l'expression des protéines par des changements dans la demi-vie fonctionnelle. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 116(48), 24075–24083. https://doi.org/10.1073/pnas.1908052116 (2019) (epub 11 novembre 2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alvarez, DR et al. Le structurome d'ARN dans les stades sanguins asexués de l'agent pathogène du paludisme plasmodium falciparum. ARN Biol. 18(12), 2480–2497. https://doi.org/10.1080/15476286.2021.1926747 (2021) (epub 2021 juin 23).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blum, L., Geisslinger, G., Parnham, MJ, Grünweller, A. & Schiffmann, S. Le composé antiviral naturel silvestrol module les macrophages et les cellules dendritiques dérivés de monocytes humains. J. Cell Mol. Méd. 24(12), 6988–6999. https://doi.org/10.1111/jcmm.15360 (2020) (epub 2020 6 mai).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ClinicalTrials.gov. Étude de l'eFT226 chez des sujets atteints de tumeurs malignes solides avancées sélectionnées (Zotatifin). NCT04092673.

ClinicalTrials.gov. Zotatifine intraveineuse chez les adultes atteints de COVID-19 léger ou modéré (PROPEL). NCT04632381.

Biedenkopf, N. et al. Le composé naturel silvestrol est un puissant inhibiteur de la réplication du virus Ebola. Antiviral Res. 137, 76–81. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2016.11.011 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Muller, C. et al. Activité antivirale à large spectre du silvestrol, inhibiteur de l'eIF4A, contre les virus corona et picornavirus. Antiviral Res. 150, 123–129. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2017.12.010 (2018) (epub 16 décembre 2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Elgner, F. et al. Inhibition de la réplication du virus Zika par le silvestrol. Virus 10(4), 149. https://doi.org/10.3390/v10040149 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Todt, D. et al. Le composé naturel silvestrol inhibe la réplication du virus de l'hépatite E (VHE) in vitro et in vivo. Antiviral Res. 157, 151–158. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2018.07.010 (2018) (epub 2018 juil. 20).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nebigil, CG et al. Les flavaglines comme produits naturels ciblant eIF4A et les prohibitines : de la médecine traditionnelle chinoise à l'activité antivirale contre les coronavirus. EUR. J. Med. Chim. 203, 112653. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2020.112653 (2020) (epub 15 juillet 2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Taroncher-Oldenburg, G. et al. Ciblage de l'hélicase à ARN DEAD-box eIF4A avec rocaglites-Une stratégie pan-antivirale pour minimiser l'impact des futures pandémies de virus à ARN. Microorganismes. 9(3), 540. https://doi.org/10.3390/microorganisms9030540 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Langlais, D. et al. Rocaglates en tant qu'agents à double ciblage pour le paludisme cérébral expérimental. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 115(10), E2366–E2375. https://doi.org/10.1073/pnas.1713000115 (2018) (epub 2018 fév 20).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drinić, M. et al. Activité de la méthylgérambulline de l'espèce Glycosmis (Rutaceae) contre Entamoeba histolytica et Giardia duodenalis in vitro. Int. J. Parasitol. Médicaments Résistance aux médicaments. 10, 109-117. https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2019.08.001 (2019) (epub 10 août 2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaparro, V. et al. Le profilage translationnel des macrophages infectés par Leishmania donovani identifie les transcrits liés au système immunitaire sensibles à mTOR et eIF4A. PLoS Pathog. 16(6), e1008291. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1008291 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bordeleau, ME et al. La suppression thérapeutique de l'initiation de la traduction module la chimiosensibilité dans un modèle de lymphome de souris. J.Clin. Investir. 118(7), 2651–2660. https://doi.org/10.1172/JCI34753 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Iwasaki, S. et al. L'inhibiteur de traduction rocaglamide cible une cavité bimoléculaire entre eIF4A et l'ARN polypurique. Cellule Mol. 73(4), 738–748.e9. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.11.026 (2019) (epub 2018 déc. 27).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sadlish, H. et al. Preuve d'un site de liaison rocaglamide fonctionnellement pertinent sur le complexe eIF4A-ARN. ACS Chem. Biol. 8(7), 1519-1527. https://doi.org/10.1021/cb400158t (2013) (epub 2013 mai 7).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chu, J. et al. La validation de la cible médicamenteuse par CRISPR révèle une inhibition pharmacologique sélective de l'hélicase à ARN, eIF4A. Cell Rep. 15(11), 2340–2347. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2016.05.005 (2016) (epub du 26 mai 2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, M., Kumakura, N., Muller, R., Shichino, Y., Nishimoto, M., Mito, M. et al. Un champignon parasite utilise eIF4A muté pour survivre sur des plantes Aglaia synthétisant du rocaglate. bioRxiv 2022.07.04.498659. https://doi.org/10.1101/2022.07.04.498659.

Sengoku, T., Nureki, O., Nakamura, A., Kobayashi, S. & Yokoyama, S. Base structurelle du déroulement de l'ARN par la protéine DEAD-box Drosophila vasa. Cellule 125(2), 287–300. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.01.054 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Oberer, M., Marintchev, A. & Wagner, G. Base structurelle pour l'amélioration de l'activité de l'hélicase eIF4A par eIF4G. Gènes Dév. 19(18), 2212–2223. https://doi.org/10.1101/gad.1335305 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cordin, O., Banroques, J., Tanner, NK et Linder, P. La famille des protéines à boîte MORTE des hélicases à ARN. Gène 15(367), 17–37. https://doi.org/10.1016/j.gene.2005.10.019 (2006) (epub 2005 Dec 7).

Article CAS Google Scholar

Morgan, AA et Rubenstein, E. Proline : La distribution, la fréquence, le positionnement et les rôles fonctionnels communs des séquences de proline et de polyproline dans le protéome humain. PLoS One 8(1), e53785. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053785 (2013) (epub 2013 janv. 25).

Corley, M., Burns, MC & Yeo, GW Comment les protéines de liaison à l'ARN interagissent avec l'ARN : molécules et mécanismes. Mol. Cellule. 78(1), 9–29. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.03.011 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, S., Daley, DT, Luscombe, NM, Berman, HM et Thornton, JM Interactions protéine-ARN : une analyse structurelle. Nucleic Acids Res. 29(4), 943–954. https://doi.org/10.1093/nar/29.4.943 (2001).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Agris, PF et al. Célébrer le décodage oscillant : un demi-siècle et encore beaucoup de nouveautés. ARN Biol. 15(4–5), 537–553. https://doi.org/10.1080/15476286.2017.1356562 (2018) (epub 2017 21 septembre).

Article PubMed Google Scholar

Lucas, X., Bauzá, A., Frontera, A. & Quiñonero, D. Une étude approfondie de l'interaction anion-π dans les biomolécules : sur l'importance des effets de coopérativité. Chim. Sci. 7(2), 1038–1050. https://doi.org/10.1039/c5sc01386k (2016) (epub 2015 juin 5).

Article CAS PubMed Google Scholar

Thomsen, MC & Nielsen, M. Seq2Logo : méthode de construction et de visualisation de motifs de liaison d'acides aminés et de profils de séquence, y compris la pondération de séquence, les pseudo-comptes et la représentation bilatérale de l'enrichissement et de l'épuisement des acides aminés. Nucleic Acids Res. 40 (problème de serveur Web), W281–W287. https://doi.org/10.1093/nar/gks469 (2012) (epub 2012 May 25).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burki , F. , Roger , AJ , Brown , MW & Simpson , AGB Le nouvel arbre des eucaryotes . Tendances Écol. Évol. 35(1), 43–55. https://doi.org/10.1016/j.tree.2019.08.008 (2020) (epub 9 octobre 2019).

Article PubMed Google Scholar

Morris, GM, Huey, R. & Olson, AJ Utilisation d'AutoDock pour l'amarrage ligand-récepteur. Courant. Protocole Bioinformer. 8, Unité 8.14. https://doi.org/10.1002/0471250953.bi0814s24 (2008).

Article Google Scholar

Muller, C. et al. Comparaison des activités antivirales à large spectre du rocaglate synthétique CR-31-B (-) et du silvestrol, inhibiteur de l'eIF4A. Antiviral Res. 175, 104706. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020.104706 (2020) (epub 10 janvier 2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dias, N. et al. La mouche des fruits d'Amérique du Sud : un insecte ravageur important avec des stades larvaires sensibles à l'ARNi. Devant. Physiol. 27(10), 794. https://doi.org/10.3389/fphys.2019.00794 (2019).

Article Google Scholar

Laland, KN Sur les causes évolutives et les processus évolutifs. Comportement Processus. 117, 97-104. https://doi.org/10.1016/j.beproc.2014.05.008 (2015) (epub 13 juin 2014).

Article PubMed Google Scholar

Lucas, JA, Hawkins, NJ & Fraaije, BA L'évolution de la résistance aux fongicides. Adv. Appl. Microbiol. 90, 29–92. https://doi.org/10.1016/bs.aambs.2014.09.001 (2015) (epub 12 novembre 2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Siegwart, M. et al. Résistance aux bio-insecticides ou comment renforcer leur durabilité : un bilan. Devant. Usine Sci. 19(6), 381. https://doi.org/10.3389/fpls.2015.00381 (2015).

Article Google Scholar

Morris, GM et al. AutoDock4 et AutoDockTools4 : Amarrage automatisé avec flexibilité de récepteur sélectif. J. Comput. Chim. 30(16), 2785–2791. https://doi.org/10.1002/jcc.21256 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trott, O. & Olson, AJ AutoDock Vina : amélioration de la vitesse et de la précision de l'amarrage avec une nouvelle fonction de notation, une optimisation efficace et le multithreading. J. Comput. Chim. 31(2), 455–461. https://doi.org/10.1002/jcc.21334 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grace, TDC Établissement d'une lignée de cellules de moustiques (Aedes aegypti L.) cultivées in vitro. Nature 211, 366–367. https://doi.org/10.1038/211366a0 (1966).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Shi, X. & Lawrence, PO Une lignée cellulaire embryonnaire de la mouche des fruits des Caraïbes, Anastrepha suspensa (Diptera : Tephritidae). Cellule In Vitro. Dév. Biol. Anim. 35, 12–14. https://doi.org/10.1007/s11626-999-0036-2 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ludewig, AH et al. L'entassement larvaire accélère le développement de C. elegans et réduit la durée de vie. PLoS Genet. 13(4), e1006717. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006717 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramirez, B. et al. Schistosomes : les défis du criblage composé. Avis d'expert. Découverte de drogue. 2(s1), S53-61. https://doi.org/10.1517/17460441.2.S1.S53 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kellershohn, J. et al. Les insectes dans la recherche sur les anthelminthiques : L'harmonine dérivée de la coccinelle affecte la survie, la reproduction et la prolifération des cellules souches de Schistosoma mansoni. PLoS Négl. Trop. Dis. 13(3), e0007240. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007240 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buckner, FS & Wilson, AJ Dosage colorimétrique pour le criblage de composés contre les amastigotes de Leishmania cultivés dans les macrophages. Suis. J. Trop. Méd. Hyg. 72(5), 600–605 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Smilkstein, M., Sriwilaijaroen, N., Kelly, JX, Wilairat, P. & Riscoe, M. Technique simple et peu coûteuse basée sur la fluorescence pour le dépistage à haut débit des médicaments antipaludiques. Antimicrobien. Agents Chemother. 48(5), 1803–1806. https://doi.org/10.1128/AAC.48.5.1803-1806.2004 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Les auteurs tiennent à remercier Christina Scheld, Georgette Stovall et Christin Ritter pour leur excellente assistance technique.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL. Ce travail a été financé par le LOEWE Center DRUID (projet A2 à AG, A4 à AH, B4 à CGG, D4 à CH et AT, D5 à MFS et IH, et E1 à SH et CGG) et le ministère allemand des sciences et de l'éducation (BMBF) via le projet HELIATAR (projet 16GW0259 à AH et projet 16GW0258K à AG) et le projet DLR (projet 01DG20023 à CH). La recherche de FCS et AHL a été financée en partie par les National Institutes of Health (R35GM131877 et U01GM110714 à FCS) et le Howard Hughes Medical Institute (Faculty Scholar Grant à FCS).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Wiebke Obermann et Mohammad Farhan Darin Bin Azri.

Institut de chimie pharmaceutique, Philipps University Marburg, Marburg, Allemagne

Wiebke Obermann, Leonie Konopka, Nina Schmidt, Francesca Magari, Andreas Heine & Arnold Grünweller

Centre de biodiversité du Sarawak, Kuching, Sarawak, Malaisie

Mohammad Farhan Darin Azri, Gilbert Sei Kung Lau, Tiong Chia Yeo & Gaspar Taroncher-Oldenbourg

Département de microbiologie, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, États-Unis

Julian Sherman et Ana Rodriguez

Institut de parasitologie, Faculté de médecine vétérinaire, Université Justus Liebig Giessen, Giessen, Allemagne

Liliana MR Silva, Carlos Hermosilla, Hicham Houhou, Simone Haeberlein, Christoph G. Grevelding & Anja Taubert

Institut Boyce Thompson, Département de chimie et de biologie chimique, Université Cornell, Ithaca, NY, États-Unis

Andreas H. Ludewig et Frank C. Schroeder

Institut de biotechnologie des insectes, Université Justus Liebig Giessen, Giessen, Allemagne

Mona Yiting Luo, Irina Hacker et Marc F. Schetelig

Gaspar Taroncher Consulting, Philadelphie, PA, États-Unis

Gaspar Taroncher-Oldenbourg

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Correspondance à Tiong Chia Yeo, Arnold Grünweller ou Gaspar Taroncher-Oldenburg.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Obermann , W. , Azri , MFD , Konopka , L. et al. Large potentiel anti-pathogène de l'hélicase à ARN à boîte DEAD ciblant les roaglates eIF4A. Sci Rep 13, 9297 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35765-6

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Reçu : 23 novembre 2022

Accepté : 23 mai 2023

Publié: 08 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35765-6

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