Conception et caractérisation d'un réseau de commutation de repliement protéique

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 431 (2023) Citer cet article

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Pour mieux comprendre comment la séquence d'acides aminés code la structure des protéines, nous avons conçu des voies de mutation qui relient trois plis communs (3α, β-grasp et α/β-plait). Les structures des protéines aux intersections à haute identité de séquence dans les voies (nœuds) ont été déterminées à l'aide de la spectroscopie RMN et analysées pour la stabilité et la fonction. Pour générer des nœuds, la séquence d'acides aminés codant pour un pli plus petit est intégrée dans la structure d'un pli plus grand d'environ 50 % et une nouvelle séquence compatible avec deux ensembles d'interactions natives est conçue. Cela génère des paires de protéines avec un pli 3α ou β-grasp dans la forme plus petite mais un pli α/β-tresse dans la forme plus grande. En outre, l'intégration de replis antagonistes plus petits crée des états critiques dans les replis plus grands, de sorte que des substitutions d'acides aminés uniques peuvent changer à la fois leur repli et leur fonction. Les résultats aident à expliquer l'ambiguïté sous-jacente dans le code de repliement des protéines et montrent que de nouvelles structures protéiques peuvent évoluer via un changement brusque de pli.

Des avancées remarquables ont récemment été réalisées dans la capacité de prédire la structure tertiaire d'une protéine à partir de sa séquence primaire d'acides aminés1,2 ainsi que dans la conception de séquences d'acides aminés qui codent pour des structures protéiques stables et uniques3. Cependant, il est également bien établi que certaines protéines ont une propension à deux conformations complètement différentes, mais bien ordonnées4,5,6,7,8,9,10,11,12. Une meilleure compréhension de l'ambiguïté du code de repliement des protéines conduirait à une meilleure compréhension de la façon dont les protéines évoluent, comment la mutation est liée à la maladie et comment la fonction peut être annotée à des séquences de structure inconnue13,14,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27. Si le code de repliement des protéines était vraiment compris, il serait possible à la fois de prédire et de concevoir des protéines qui subissent de profonds changements de conformation. Des progrès significatifs ont été accomplis dans la compréhension des protéines naturelles qui changent de pli11 et dans la prédiction des protéines naturelles de changement de pli à partir des données de séquence d'acides aminés25. Concevoir des protéines à l'interface entre différents plis a été possible7,28,29,30 mais présente toujours un formidable défi. Il a été particulièrement difficile de concevoir des protéines monomères qui changent de pli sans modifier la structure quaternaire, et une meilleure compréhension est nécessaire sur la façon dont un sous-ensemble très limité d'interactions intra-protéiques peut faire basculer l'équilibre d'un pli et fonctionner à un autre29,31, 32.

Notre objectif ici était de concevoir des protéines monomères qui sont dans un état critique entre deux plis distincts. Pour ce faire, nous avons choisi trois plis protéiques bien étudiés et conçu une série de séquences telles que chaque séquence est compatible avec deux ensembles d'interactions natives. Deux de ces plis proviennent de la protéine G streptococcique qui contient deux types de domaines qui se lient aux protéines sériques dans le sang : le domaine GA se lie à l'albumine sérique humaine (HSA)33,34 et le domaine GB se lie à la région constante (Fc) de IgG35,36. La troisième protéine est S6, un composant de la sous-unité ribosomale 30S de Thermus thermophilus37,38,39,40,41. Pour plus de simplicité, le pli S6 est appelé pli S, le pli GA un pli A et le pli GB un pli B. Ces protéines ne partagent aucune homologie de séquence significative et sont représentatives de trois des dix plis les plus courants : le pli S est une tresse α/β de type thiorédoxine ; le pli A est un faisceau d'hélices 3α de type homéodomaine; et le pli B est une prise β de type ubiquitine42.

La figure 1 représente un réseau d'intersections de séquences à haute identité (nœuds) qui relient les trois plis. Les flèches de la figure 1 montrent un réseau provenant de la séquence S6 naturelle. Les cercles représentent les nœuds du réseau au niveau desquels des commutations structurelles et/ou fonctionnelles se produisent. Les nœuds SI et S'I sont des points de branchement et conduisent à des voies de séquences divergentes, l'une menant à un nœud avec le pli A (S/A) et l'autre à un nœud avec le pli B (S/B). Des voies mutationnelles croisées mènent de S/A à la protéine GA native et de S/B à la protéine GB native. À cette intersection (A/B), un pli A passe à un pli B.

S6 est la séquence d'origine dans le processus d'ingénierie. SI et S'I sont des nœuds séparés et sont des variantes de la taille d'une boucle du pli S, tous deux ayant des fonctions d'inhibiteur de protéase. La branche SI du chemin mutationnel conduit à un nœud avec la fonction de liaison A-fold et HSA. La branche S'I du chemin conduit à un nœud avec la fonction de liaison B-fold et IgG. Le nœud S/A (cercles bleus et rouges) comprend les protéines Sa1, Sa2, A1 et A2. Le nœud S/B (cercle bleu et vert) comprend les protéines Sb3, Sb4, Sb5, B3 et B4. Les chemins A et B eux-mêmes se croisent à un nœud A/B (cercles verts et rouges) au niveau duquel les plis A et B sont presque iso-énergétiques et bifonctionnels. Les branches S et S 'continuent et se connectent à de nombreuses autres séquences naturelles de la famille des super-plis tressés α / β.

Les protéines autour du nœud A/B ont été largement caractérisées dans nos travaux antérieurs29,31,32. Ici, nous déterminons que GA et GB peuvent basculer dans un troisième pli (tresse α / β) et montrons que ces trois plis et quatre fonctions (liaison HSA, liaison IgG, inhibition de la protéase et liaison à l'ARN) peuvent être connectés dans un réseau qui évite les états dépliés et sans fonction. Nous décrivons comment ces nœuds ont été conçus, déterminons les structures clés à l'aide de la spectroscopie RMN et analysons la stabilité et la fonction de liaison. La capacité de concevoir et de caractériser des nœuds reliant trois petits plis communs suggère que la commutation de pli peut être une caractéristique intrinsèque du code de repliement des protéines et est importante dans l'évolution de la structure et de la fonction des protéines.

La protéine ribosomique S6 est structurellement homologue aux inhibiteurs de subtilisine protéase connus sous le nom de prodomaines (Fig. 2a, b)43,44. Les inhibiteurs de type prodomaine ont deux surfaces de liaison avec la protéase. Une surface comprend les neuf derniers acides aminés C-terminaux de l'inhibiteur qui se lient dans la fente de liaison au substrat de la protéase (Fig. 2b). Une seconde surface, plus dynamique, est formée entre deux hélices de subtilisine et la grande surface du feuillet β dans la topologie α/β-tresse de l'inhibiteur (Fig. 2b)45,46,47. En conséquence, la protéine S6 pourrait être convertie en une protéine inhibitrice de la subtilisine du même pli global (notée SI) en remplaçant ses neuf acides aminés C-terminaux par des résidus optimisés pour se lier dans la fente de liaison au substrat de la subtilisine. Ce remplacement entraîne de nouveaux contacts entre le feuillet SI β et les hélices de surface de la subtilisine (Fig. 2b).

a Structure de la protéine S6 (jaune), de l'ARN (bleu clair) et des protéines S15 et S18 (bleu) dans le ribosome 30S (PDB 1FKA [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb], réf. 43 ). Les acides aminés C-terminaux de S6 sont en magenta. b La subtilisine (blé) est représentée en complexe avec un modèle de l'inhibiteur SI (jaune). Les neuf acides aminés C-terminaux de SI sont représentés en magenta. Ces positions ont été mutées dans S6 natif pour générer une affinité pour la subtilisine. L'inhibiteur S'I (bleu sarcelle) est également représenté avec les boucles altérées en rouge. La subtilisine utilisée dans la modélisation était la protéase spécifique de RAS modifiée. c La protéine Sa1 (bleue et verte) a été générée à partir de SI en mutant les 45 positions (chaînes latérales mutantes représentées avec des bâtons). La suppression des acides aminés C-terminaux (bleu) fait basculer Sa1 dans le pli A (vert). d La protéine Sb3 (rose et cyan) a été générée à partir de S'I en mutant les 67 positions (chaînes latérales mutantes représentées par des bâtons). La suppression des acides aminés C-terminaux (cyan) ou la mutation ponctuelle transformera Sb3 en un pli B (rose). e Modèle de Sa2I (vert et bleu) lié à la subtilisine (blé). Modèle de A2 (basé sur la structure A1) lié à HSA (violet). Le complexe HSA a utilisé PDB 2VDB (réf. 50) comme modèle. f Modèle de Sb3 (rose et cyan) lié à la subtilisine (blé). Modèle de B4 (rose) lié à Fc (menthe). Le complexe Fc a utilisé PDB 1FCC (réf. 51) comme modèle. La subtilisine utilisée dans la modélisation et les mesures d'inhibition était la protéase spécifique de RAS PDB 6UAO (réf. 49).

La protéine SI a une longueur de 99 acides aminés et possède une boucle de 10 résidus entre β2 et β3. Cependant, il existe de nombreuses variations naturelles dans la longueur des boucles dans la topologie conservée des tresses α/β48. Par conséquent, nous avons également conçu une version à 91 acides aminés du pli S (notée S'I), qui ressemble à la topologie des inhibiteurs naturels du prodomaine (Fig. 1 supplémentaire). Plus précisément, l'inhibiteur S'I a une boucle plus longue reliant β1 à α1 et un tour plus court reliant β2 à β3 (Fig. 2b).

Les protéines SI et S'I ont été exprimées et purifiées par liaison à une colonne de protéase49. Les spectres CD ont été comparés à la protéine S6 native (Fig. 1 supplémentaire). Les constantes d'inhibition (KI) ont été mesurées à l'aide d'une subtilisine protéase spécifique à RAS et du substrat peptidique QEEYSAM-AMC49. SI et S'I inhibent la protéase spécifique de RAS avec des valeurs de KI de 200 et 60 nM, respectivement (tableau supplémentaire 1). Les détails du test d'inhibition compétitive sont décrits dans la section "Méthodes". Les résultats démontrent qu'une protéine ribosomique peut être convertie en un inhibiteur de protéase avec une modification mineure (et sans fold switch). De plus, cependant, les protéines SI et S'I ont également facilité l'ingénierie des changements ultérieurs vers de nouveaux plis et fonctions en liant chacun des plis S, A et B à des fonctions de liaison facilement mesurables : inhibition de la protéase (S ou S' -pli); Liaison HSA (pli A, Fig. 2e)50 ; et liaison IgG (pli B, Fig. 2f)51.

Dans des travaux antérieurs, nous avons créé des séquences qui peuplent les plis A et B en enfilant la séquence A à travers le pli B, en trouvant un alignement prometteur, puis en utilisant la sélection par phage display pour réconcilier une séquence avec les deux plis29,52, 53. Ici, l'approche est conceptuellement similaire, sauf que nous utilisons Rosetta54 comme outil de conception informatique pour tester des mutations compatibles plutôt que l'affichage de phages. Le processus de conception est le suivant :

Enfilez la séquence A ou B dans les types de plis SI et S'I.

Identifiez les alignements qui minimisent le nombre d'interactions catastrophiques.

Concevez des mutations pour résoudre les interactions défavorables dans des grappes de 4 à 6 acides aminés à l'aide de Pymol55 et minimisez l'énergie à l'aide de Rosetta-Relax54.

Optimisez la stabilité des protéines dans le pli S en mutant par ordinateur des acides aminés à des positions sans chevauchement. Répétez la minimisation et l'évaluation de l'énergie avec Rosetta-Relax.

Pour réduire les incertitudes liées à la conception informatique, conservez les acides aminés d'origine dans la mesure du possible.

Il n'y a aucune raison de supposer que cette méthode est optimale. Nous appliquons simplement un schéma pratique pour concevoir des séquences compatibles avec deux ensembles d'interactions natives, puis évaluons la structure, la stabilité et la fonction. Les conceptions initiales ont été affinées sur la base d'une analyse structurelle avec RMN, d'une analyse thermodynamique du dépliement et d'une analyse fonctionnelle à l'aide d'essais de liaison, comme décrit ci-dessous. Toutes les protéines conçues ont été exprimées dans E. coli et purifiées jusqu'à homogénéité comme décrit dans la section "Méthodes".

L'alignement de la liaison HSA de 56 acides aminés, du pli A avec le pli SI de 99 acides aminés et la mutation ultérieure pour résoudre les interactions catastrophiques ont produit des candidats de commutation à faible énergie notés Sa1 et A1. La séquence exacte de A1 est intégrée dans Sa1 aux positions 11 à 66 de sorte que les hélices α1 sont structurellement alignées (Fig. 3a, Fig. 2A supplémentaire). Leurs modèles de calcul finaux ont été générés par Rosetta à l'aide de l'application Relax. Le protocole Relax recherche l'espace conformationnel local autour d'une structure déterminée expérimentalement et est utilisé uniquement pour évaluer si les mutations conçues ont des interactions natives favorables dans cet espace conformationnel limité. Les modèles conçus de Sa1 et A1 sont très similaires en énergie par rapport aux structures natives relaxées respectives (Fig. 3 supplémentaire et fichiers de données source).

a Alignement des séquences de A1 et Sa1, qui sont identiques à 100 % sur la région A de 56 acides aminés. b Spectres HSQC 1H-15N bidimensionnels superposés de Sa1 (noir) et A1 (rouge) avec des attributions d'amide de squelette. Les spectres ont été enregistrés à 25 et 5 °C, respectivement. c Ensemble de 10 structures CS-Rosetta de plus basse énergie pour A1 (panneau de gauche). Superposition de la structure A1 (vert) avec le pli GA parent (orange) (panneau de droite). d Ensemble de 10 structures CS-Rosetta d'énergie la plus basse pour Sa1 (panneau de gauche). Superposition de Sa1 (vert) avec le pli parent S6 (orange) (panneau de droite). e Dynamique du squelette dans les protéines conçues. Tracé des valeurs de NOE hétéronucléaires à l'état d'équilibre {1H}-15N à 600 MHz par rapport au résidu pour A1 (rouge) et pour Sa1 (noir). Chaque ensemble de NOE hétéronucléaires a été obtenu à partir d'une seule expérience. Les erreurs ont été estimées sur la base du niveau de bruit de fond mesuré.

Dans l'ensemble, la topologie du faisceau hélicoïdal 3α de A1 est très similaire à la structure parente GA dont elle est dérivée56. Les attributions de déplacement chimique spécifiques à la séquence pour A1 (Fig. 3b) ont été utilisées pour calculer une structure 3D avec CS-Rosetta (Fig. 3c, Tableau 1). Nos études précédentes ont indiqué une correspondance étroite entre les structures CS-Rosetta et de novo pour les plis A et B avec une identité de séquence élevée57. Les résidus N-terminaux 1 à 4 et les résidus C-terminaux 53 à 56 ont une structure désordonnée, ce qui correspond aux données de NOE hétéronucléaires à l'état d'équilibre {1H} -15N (Fig. 3e). De même, Sa1 a la même topologie βαββαβ globale que la structure parente S6 (Fig. 3d, Tableau 2). Les déplacements chimiques du squelette (Fig. 3b) ont été utilisés en combinaison avec des NOE inter-protons de la chaîne principale (Fig. 4 supplémentaire) pour déterminer une structure tridimensionnelle utilisant CS-Rosetta (PDB 7MN1). L'ensemble conformationnel montre des éléments bien définis de structure secondaire aux résidus 2–10 (β1), 16–32 (α1), 40–44 (β2), 59–67 (β3), 73–81 (α2) et 86 –92 (β4). La principale différence avec la structure native est que le brin β2 est plus court de sept acides aminés dans Sa1 que dans S6. Les données hétéronucléaires de NOE montrent une cohérence globale avec la structure, indiquant que la longue boucle entre les brins β2 et β3 des résidus 45 à 58 est plus flexible que les autres régions internes de la chaîne polypeptidique (Fig. 3e).

Bien que la séquence de 56 acides aminés de A1 soit identique à 100 % aux résidus 11 à 66 de Sa1, une fraction importante du squelette subit des changements entre les deux structures. Plus particulièrement, alors que les hélices α1 dans A1 et Sa1 sont de longueur similaire, les régions correspondant aux hélices α2 et α3 de A1 forment les brins β2 et β3 de Sa1 (Fig. 4a). Les acides aminés du noyau dans l'hélice α1 de A1 correspondent à des résidus qui contribuent également au noyau de Sa1. Cependant, l'hélice α1 dans Sa1 entre en contact avec un ensemble de résidus presque entièrement différent (Fig. 4b). Par exemple, les acides aminés L51, Y53 et I55 dans la queue C-terminale de A1 n'ont pas de contact étendu avec α1 mais les résidus correspondants dans Sa1 (L61, Y63 et I65) forment des interactions centrales étroites avec α1 dans le cadre de la brin β3. La plupart des autres résidus centraux en contact avec l'hélice α1 de Sa1 se trouvent en dehors de la région de 56 acides aminés codant pour le pli A1. Ceux-ci incluent F4, V6, I8 et L10 du brin β1; A67 du brin β3; V72, L75 et L79 de l'hélice α2 ; et V85 de la boucle entre l'hélice α2 et le brin β4. Deux résidus supplémentaires, V88 et V90 (β4) contribuent également de manière significative au noyau mais ne contactent pas α1. Ainsi, à l'exception de l'alignement topologique d'origine des hélices α1, les noyaux des plis 3α et α / β ne se chevauchent en grande partie pas. Au total, environ la moitié des résidus participant au noyau Sa1 ne sont pas présents dans la séquence A1.

a Comparaisons de la chaîne principale. (Panneau de gauche) Structure CS-Rosetta de A1 avec codage couleur pour les éléments structurés secondaires. (Panneau de droite) Régions à code couleur correspondantes cartographiées sur la structure CS-Rosetta de Sa1, illustrant les changements dans la conformation du squelette. Les régions en dehors de la séquence de 56 acides aminés de A1 sont représentées dans le blé. b Comparaisons de chaînes latérales. (Panneau de gauche) Résidus contribuant au noyau de A1 à partir de l'hélice α1 (jaune) et d'autres régions (cyan). Les résidus de noyau non-α1 de Sa1 (rose) ne se chevauchent pas avec le noyau A1 (voir le texte pour plus de détails). (Panneau de droite) Résidus contribuant au noyau de Sa1 à partir de l'hélice α1 (jaune) et la plupart des autres résidus de noyau participants (rose). Les résidus de noyau non-α1 de A1 sont également représentés (cyan), mettant en évidence le faible degré de chevauchement.

Les spectres CD UV lointains ont été mesurés pour Sa1 et A1 et leurs profils de dépliement thermique ont été déterminés en mesurant l'ellipticité à 222 nm en fonction de la température (Fig. 5 et Fig. 5 supplémentaire). Sa1 a un TM d'environ 100 ° C et un repliement ∆ G estimé de -5,3 kcal / mol à 25 ° C (Fig. 5b, tableau supplémentaire 1)58. Le repliement ∆G du parent S6 est de −8,5 kcal/mol40. L'énergie Rosetta de la conception Sa1 est similaire à celle de la séquence native (Fig. 3 supplémentaire). A1 a un TM de 65 ° C et un ∆ Gfolding = -4,0 kcal / mol à 25 ° C58 (Fig. 5a, tableau supplémentaire 1). Le repliement ∆G du GA parent est de −5,6 kcal/mol59,60. L'énergie Rosetta de la conception A1 est légèrement plus favorable que celle de la séquence native (Fig. 3 supplémentaire).

a Ellipticité à 222 nm en fonction de la température pour les variations A et B. b Ellipticité à 222 nm tracé en fonction de la température pour les variations S. Sb0 est une variante à faible stabilité (F7V) de Sb1 utilisée pour mesurer la dépendance à la température de l'état déplié. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'ingénierie initiale du commutateur pliable a été réalisée sans tenir compte de la préservation de la fonction. En conséquence, A1 n'a pas d'affinité de liaison HSA détectable parce que deux acides aminés dans l'interface de liaison ont été mutés. Cependant, une liaison HSA significative est récupérée lorsque les mutations de surface, E28Y et K29Y, sont réalisées dans A1 (notées A2). Ces mutations ne semblent pas affecter la structure de A1 (Fig. 5 supplémentaire) mais entraînent une liaison HSA de KD ≤ 1 µM (Tableau supplémentaire 1). Ceci a été déterminé en mesurant la liaison à la HSA immobilisée comme décrit dans la section "Méthodes".

Sa1 ne se lie pas à la protéase car les acides aminés C-terminaux n'ont pas été conservés dans sa conception. Il peut cependant être converti en inhibiteur de protéase en remplaçant ses trois acides aminés C-terminaux (AAD) par DKLYRAL (noté Sa1I). Une version de Sa1I a également été réalisée qui contient la séquence exacte de 56 acides aminés A2 en réalisant des mutations E38Y, K39Y (notées Sa2I). Sa1, Sa1I et Sa2I ont une structure similaire par analyse CD (Fig. 5 supplémentaire). La constante d'inhibition de Sa2I avec la subtilisine modifiée a été déterminée à 50 nM comme décrit dans la section "Méthodes" (tableau supplémentaire 1). Ainsi, un pli A stable avec une fonction de liaison à la HSA peut être intégré dans un pli S de 99 acides aminés avec une fonction d'inhibiteur de protéase (Fig. 2c, e). Il convient de noter que tous les acides aminés de contact HSA sont conservés dans les séquences A2 et Sa2I, mais la topologie tridimensionnelle nécessaire pour former la surface de contact HSA ne se produit que dans le pli A50. Néanmoins, il a été observé que Sa2I se liait faiblement à HSA (KD ~ 100 µM, tableau supplémentaire 1). Cette faible affinité suggère que certaines molécules Sa2I peuvent peupler le pli 3α même si le pli α/β-tresse prédomine fortement.

Lors de la conception d'un commutateur S-to-B-fold, nous avons utilisé deux alignements topologiques. Le premier se situait entre les plis SI et B, où les brins β1 de chaque pli étaient alignés (Figs. 2B et 6A supplémentaires). Le deuxième alignement était entre les plis S'I et B, où la longue boucle entre β2 et β3 dans SI a été raccourcie dans S'I pour être plus cohérente avec les inhibiteurs de protéase naturels. Dans ce schéma, la topologie α1β3β4 du pli B était alignée sur la topologie α1β2β3 du pli S'I (Fig. 6a, Fig. 2C supplémentaire).

a Alignement des séquences de B4 et Sb3, différant d'un résidu (L5Y) sur la région B de 56 acides aminés. b Spectres HSQC 1H-15N bidimensionnels superposés de Sb3 (noir) et B4 (rouge) avec des attributions d'amide de squelette. Les spectres ont été enregistrés à 25 °C. Le pic A56 est un signal replié. Les pics marqués d'un astérisque diminuent en intensité relative à mesure que la concentration de B4 est abaissée, indiquant la présence d'un dimère putatif faiblement associé en plus du monomère. c Ensemble de 10 structures CS-Rosetta de plus basse énergie pour B4 (panneau de gauche). Superposition de la structure B4 (vert) avec le pli parent GB (orange) (panneau de droite). d Ensemble de 10 structures CS-Rosetta d'énergie la plus basse pour Sb3 (panneau de gauche). Superposition de Sb3 (vert) avec le pli parent S6 (orange) (panneau de droite). e Tracé des valeurs de NOE hétéronucléaires à l'état d'équilibre {1H}-15N à 600 MHz par rapport au résidu pour B4 (rouge) et Sb3 (noir). Chaque ensemble de NOE hétéronucléaires a été obtenu à partir d'une seule expérience. Les erreurs ont été estimées sur la base du niveau de bruit de fond mesuré.

Dans la première approche, l'alignement des brins β1 du pli B et du pli S et la mutation subséquente pour résoudre les interactions catastrophiques ont produit des candidats de commutation à faible énergie notés B1 et Sb1. La séquence exacte de B1 est intégrée dans Sb1 aux positions 4 à 59 (Fig. 6A supplémentaire). Les modèles informatiques de B1 et Sb1 montrent des augmentations d'énergie relativement faibles par rapport aux structures natives relaxées correspondantes (Fig. 3 supplémentaire). La structure RMN de B1 présentait une topologie ββαββ identique à celle du pli B parent, avec un squelette RMSD d'environ 0, 6 Å (Fig. 6B, C supplémentaires). Cependant, la topologie de Sb1 n'est pas la même que celle de la structure parente S6 et présente à la place un pli similaire à celui de B1 (Figs. 6B, D et 7 supplémentaires, PDB 7MQ4). L'introduction de 13 mutations dans Sb1 a généré une protéine notée Sb2 (Fig. 8 supplémentaire). Sb2 contient quatre brins β et deux hélices α et présente les caractéristiques générales du pli S parent (Fig. 9 supplémentaire, PDB 7MN2). Cependant, la version à 56 acides aminés de Sb2 (notée B2) a une énergie Rosetta significativement plus élevée que B1 et est vraisemblablement dépliée (Fig. 3 supplémentaire). Ainsi, ni les paires de protéines B1/Sb1 ni B2/Sb2 n'ont abouti à des séquences d'identité élevée avec des plis différents. Néanmoins, B1 est identique à 80% à la région intégrée correspondante dans la protéine Sb2 repliée en S (Fig. 9A supplémentaire). Les structures de B1, Sb1 et Sb2 sont décrites plus en détail dans le Supplément et les Tableaux 1 et 2.

Pour améliorer la conception du commutateur S-to-B, nous avons aligné le pli B avec le pli inhibiteur de S 'et choisi un alignement qui crée une correspondance topologique entre α1β3β4 en B et α1β2β3 en S' (Fig. 2C supplémentaire). La mutation pour résoudre les interactions délétères dans cet alignement a produit des candidats de commutation à faible énergie notés B3 et Sb3 (Fig. 10 supplémentaire). La séquence exacte de B3 est intégrée dans Sb3 aux positions 1–56. L'énergie du modèle de calcul pour Sb3 est légèrement plus favorable que la structure native relâchée. Le modèle conçu de B3 montre des augmentations d'énergie relativement faibles par rapport à la structure native détendue (Fig. 3 supplémentaire).

La détermination de la structure basée sur la RMN a indiqué que Sb3 a une structure secondaire βαββαβ et une topologie en S (Fig. 6a, b, d, PDB 7MP7). Les régions ordonnées correspondent aux résidus 4–10 (β1), 24–37 (α1), 42–46 (β2), 51–56 (β3), 62–70 (α2) et 79–85 (β4). La comparaison de Sb3 avec le pli S parent indique que la partie β1/α2/β4 du pli est similaire dans les deux cas. En revanche, la boucle β1 – α1 est plus longue dans Sb3 (13 résidus) que dans le pli S parent (5 résidus), tandis que α1, β2, la boucle β2 – β3 et β3 sont toutes plus courtes que chez le parent (Fig. .6d). Conformément à la structure Sb3, la boucle β1-α1 de 13 acides aminés est très flexible (Fig. 6e). Nous avons également exprimé et purifié une protéine tronquée correspondant au pli B intégré, la version à 56 acides aminés de Sb3 (notée B3). Le spectre HSQC 2D 1H – 15N de B3 à 5 ° C et à de faibles concentrations (<20 μM) était cohérent avec un pli B monomère prédominant (Fig. 11 supplémentaire), mais a montré un élargissement significatif des échanges à 25 ° C, indiquant une faible stabilité (voir ci-dessous). Vraisemblablement, la faible stabilité est due au tassement moins favorable de Y5 dans le noyau du pli B par rapport à une leucine aliphatique plus petite. Cependant, des espèces supplémentaires, putativement oligomères, étaient également présentes pour lesquelles les intensités maximales relatives augmentaient avec l'augmentation de la concentration en protéines. En raison de sa stabilité relativement faible et de l'hétérogénéité de l'échantillon, B3 n'a pas été davantage analysé structurellement.

Nous avons utilisé la structure RMN de Sb3 pour concevoir une mutation ponctuelle, la tyrosine 5 en leucine (Y5L), qui stabiliserait le pli B intégré sans compromettre les contacts natifs dans le pli S (Figure 10 supplémentaire). Ce mutant devait donc déplacer la population vers le pli B. Deux mutants ont été préparés, un mutant Y5L de Sb3 (noté Sb4) et un mutant Y5L de B3 (noté B4). B4, est en effet plus stable que B3 (Fig. 5a, Tableau supplémentaire 1). L'attribution et la détermination de la structure de B4 ont montré que sa topologie était identique au pli B parent (Fig. 6b, c). À des concentrations supérieures à 100 μM, B4 a affiché une tendance à une faible auto-association similaire à celle observée pour B3. Pour Sb4, le spectre HSQC présentait environ deux fois plus de pics croisés d'amide par rapport à Sb3 (Fig. 7a), ce qui suggère que les états S et B étaient peuplés simultanément. Cela a été confirmé par l'attribution RMN et également par une comparaison des spectres HSQC pour Sb4, B4 et Sb3. Une fraction significative des signaux d'amide du squelette Sb4 (~ 50 pics) correspondait étroitement à ceux de B4, indiquant la présence d'un état B (Fig. 12A – C supplémentaires). La correspondance étroite de ces pics est probablement due au fait que les résidus 1 à 56 dans l'état B de Sb4 ont une séquence identique à B4. Les plus grandes perturbations de déplacement d'amide entre l'état B de Sb4 et B4 se produisent pour les résidus proximaux de l'extrémité C-terminale du pli B, tels que G41, où Sb4 a des résidus supplémentaires et B4 n'en a pas. De nombreux signaux Sb4 correspondaient également bien à Sb3, bien que le degré de similitude ne soit pas aussi étendu qu'avec B4 (Fig. 12D – F supplémentaire). Des différences de déplacement chimique d'amide plus importantes entre l'état S de Sb4 et Sb3 sont probablement dues à la mutation Y5L, qui est un changement relativement important situé à côté du noyau. Pour résoudre ces ambiguïtés, des affectations de résonance dorsale ont été faites pour l'état S de Sb4 (Fig. 7a, [https://doi.org/10.13018/BMR51719] voir la section "Méthodes" pour plus de détails). La comparaison des affectations de l'état S de Sb4 avec Sb3 a indiqué que la plupart des perturbations de déplacement d'amide plus importantes se trouvaient dans les brins β1 et β4. L'analyse de décalage secondaire a montré que le schéma des éléments de structure secondaire pour l'état S de Sb4 est similaire à celui de Sb3 (Fig. 7b). L'analyse NOE inter-proton a indiqué que l'arrangement des brins β est également similaire (Fig. 7c). Ensemble, ces résultats montrent que Sb4 remplit les plis S et B à peu près également à 25 ° C. De plus, un spectre d'échange ZZ a démontré que les états S et B de Sb4 sont en échange conformationnel lent sur l'échelle de temps RMN (Fig. 7d).

a Spectres HSQC bidimensionnels 1H – 15N de Sb4 (à gauche), B4 (au centre) et Sb3 (à droite) à 25 ° C. Dans le spectre Sb4, les attributions de résonance amide du squelette sont indiquées pour l'état S (bleu) et l'état B (rouge). b Niveaux de confiance des régions de structure secondaire ordonnées pour l'état S de Sb4 à 30 ° C (rouge) et pour Sb3 à 25 ° C (gris) à partir de déplacements chimiques à l'aide de TALOS-N. Les éléments de structure secondaire de Sb3, déterminés à partir de la structure tridimensionnelle, sont présentés au-dessus du tracé. c Résumé des NOE du squelette à longue portée à partir des données 3D 15N-NOESY pour Sb3 à 25 °C (noir) et l'état S de Sb4 à 30 °C (rouge). d Région Gly41 du spectre d'échange ZZ de 300 ms pour Sb4 à 25 ° C, montrant des pics d'échange entre les états S et B.

Enfin, nous avons conçu une mutation de la leucine 67 en arginine (L67R) dans Sb4 pour déstabiliser le pli S sans changer la séquence du pli B intégré. Le mutant est désigné par Sb5 (Fig. 10 supplémentaire). On s'attendait à ce que la population passe au pli B. Le spectre HSQC 2D 1H-15N de Sb5 indique que la mutation L67R déstabilise effectivement le pli S, avec la perte de pics croisés d'amide de type S et l'apparition simultanée d'un nouvel ensemble de signaux indiquant un passage à un B- pli. La superposition du spectre de Sb5 avec celui de B4 montre que les nouveaux signaux dans Sb5 correspondent largement au spectre de B4 (Fig. 13 supplémentaire). Ainsi, la mutation L67R déplace l'équilibre du pli S vers le pli B. Les signaux supplémentaires (~ 25–30) dans la région centrale du spectre HSQC qui ne sont pas détectés dans B4 sont probablement dus à la queue C-terminale désordonnée de Sb5. La queue C-terminale de Sb5 ne semble pas interagir de manière importante avec le pli B, comme en témoignent quelques changements dans les déplacements chimiques ou les intensités maximales dans la région B de Sb5 par rapport à B4.

Les acides aminés alignés 1 à 56 de Sb3 et B4 ont une identité de séquence de 98 %, la seule différence étant une mutation L5Y dans Sb3 (Fig. 6a). Les plis globaux de Sb3 et B4 présentent cependant des différences à grande échelle (Fig. 8a, Fig. 4 supplémentaire). Les brins β1, bien que de longueur similaire, sont dans des directions opposées dans Sb3 et B4. Le brin β1 forme une interaction parallèle avec β4 dans B4, mais une interaction antiparallèle avec le brin β3 correspondant dans Sb3. Alors que les résidus 9-20 forment le tour β1–β2 à 6 résidus et le brin β2 à 6 résidus de B4, ces mêmes acides aminés constituent l'extrémité de β1 et 10 résidus de la boucle β1–α1 largement désordonnée dans Sb3. Le reste de la région B est topologiquement similaire, avec la structure α1/β3/β4 dans B4 correspondant à la structure α1/β2/β3 dans Sb3. Dans l'ensemble, cependant, l'ordre des liaisons H dans les feuillets β à 4 brins est assez différent, avec β2β3β1β4 dans Sb3 et β3β4β1β2 dans B4.

a Comparaisons de la chaîne principale. (Panneau de gauche) Structure CS-Rosetta de B4 avec éléments de structure secondaires codés par couleur. (Panneau de droite) Régions à code couleur correspondantes cartographiées sur la structure CS-Rosetta de Sb3, montrant les changements dans la conformation du squelette. Les régions en dehors de la séquence de 56 acides aminés de B4 sont représentées dans le blé. b Comparaisons de chaînes latérales. (Panneau de gauche) Résidus contribuant au noyau de B4 à partir de α1/β3/β4 (jaune) et d'autres régions (cyan). Les résidus de noyau non α1/β2/β3 de Sb3 (rose) ne se chevauchent pas avec le noyau B4 (voir le texte pour plus de détails). (Panneau de droite) Résidus contribuant au noyau de Sb3 à partir de α1/β2/β3 (jaune) et des autres résidus de noyau participants (rose). Les résidus de noyau non α1/β2/β3 de B4 sont également représentés (cyan). La différence d'acide aminé L5Y unique entre B4 et Sb3 est mise en évidence.

Les principaux résidus centraux de B4 sont constitués de Y3, L5, L7 et L9 de β1, A26, F30 et A34 de α1, et F52 et V54 de β4 (Fig. 8b). Dans Sb3, les régions topologiquement équivalentes du noyau sont A26, F30 et A34 de α1, et F52 et V54 de β3. Les résidus Y5, L7 et L9 du brin β1 de Sb3 font également partie du noyau, mais avec un tassement différent de B4 en raison de l'orientation inverse de β1. Les résidus A12 et A20, qui contribuent à la périphérie du noyau dans B4, sont accessibles au solvant dans la boucle β1-α1 de Sb3. La plupart des résidus centraux restants de Sb3 proviennent de l'extérieur de la région B et comprennent des acides aminés de β3 (A56), α2 (V64, L67, A68, L71) et β4 (V80 et I82).

Les spectres CD UV lointains ont été mesurés pour B3, B4, Sb3, Sb4 et Sb5 et leurs profils de dépliement thermique ont été déterminés en mesurant l'ellipticité à 222 nm en fonction de la température (Fig. 5, Fig. 10 supplémentaire, Tableau supplémentaire 1). Comme décrit ci-dessus, la forme prédominante de Sb3 est un pli S. Les analyses CD et RMN montrent que B3 est principalement un pli B avec un ∆Gfolding de -1,2 kcal/mol à 25 °C58. D'après l'analyse RMN, il apparaît que le pli B est en équilibre avec des états putativement dimères. Cela crée une situation dans laquelle le pli B dépend à la fois de la température et de la concentration. La forme prédominante à 5 ° C et ≤ 18 µM est cependant le pli B. La faible stabilité et le comportement dépendant de la concentration de B3 peuvent indiquer qu'une certaine propension aux conformations de type S pourrait persister dans la protéine à 56 résidus.

Sb4 a un profil de déploiement de température très similaire à Sb3 (Fig. 5) même si S- et B- sont à peu près également peuplés à 25 ° C dans Sb4 (Fig. 7). Cela montre que la mutation Y5L entraîne deux plis qui sont presque isoénergétiques et tous deux thermodynamiquement stables par rapport à l'état déplié. De plus, étant donné que les plis S et B sont en équilibre et peuplés à peu près de la même manière, l'énergie libre du passage au pli B à partir du pli S (∆GB-fold/S-fold) est d'environ 0 kcal/mol à 25 °C. L'équilibre de commutation reflète l'influence du pli B antagoniste sur la population de pli S dans Sb4, où la leucine au niveau du résidu 5 aide à stabiliser l'état B alternatif aux dépens de l'état S. La dénaturation thermique par CD montre que B4 a un ∆Gfolding = −4,1 kcal/mol à 25 °C58. Le profil de dépliement thermique de Sb5 montre une transition à basse température avec un point médian d'environ 10 ° C et une transition majeure avec un point médian d'environ 60 ° C (Fig. 5b). L'analyse RMN indique que la transition majeure est le déploiement du pli B. Ainsi, l'arginine à 67 dans Sb5 rend le pli B plus favorable en rendant le pli S défavorable, ce qui est cohérent avec le changement de population du pli mixte au pli B observé par RMN.

La protéine Sb3 est étroitement liée à S'I mais n'a pas de fonction inhibitrice car les acides aminés C-terminaux ont été modifiés dans la conception du commutateur. Il peut cependant être converti en inhibiteur de protéase en modifiant les acides aminés C-terminaux VTE en DKLYRAL. Ce mutant est noté Sb3I. Sb3 et Sb3I semblent avoir une structure similaire par analyse CD (Fig. 10 supplémentaire). Le KI pour Sb3I avec la subtilisine modifiée a été déterminé à 50 nM (tableau supplémentaire 1).

La liaison aux IgG a été déterminée pour B3 et Sb3I (tableau supplémentaire 1). B3 et Sb3I liés à IgG Sepharose avec KD ≤ 1 µM et 10 µM, respectivement. Vraisemblablement, Sb3I a une activité de liaison IgG significative parce que la surface de liaison IgG α1β3 du pli B est largement préservée dans le pli S. Ainsi, Sb3I est une protéine à double fonction avec à la fois des fonctions de liaison aux IgG et d'inhibiteur de protéase (Fig. 2f).

L'ensemble du réseau de voies croisées entre les plis S, A et B est résumé à la Fig. 9. Le premier nœud de la voie est un passage fonctionnel de la protéine de liaison à l'ARN à l'inhibiteur de protéase sans changement de repli. La tresse α/β est un pli commun, et les protéines avec cette topologie de base incluent de nombreuses fonctions différentes42. L'ingénierie des nœuds SI et S'I illustre comment la fonction d'inhibiteur de protéase peut survenir dans la topologie de la tresse α/β avec quelques mutations. Le remplacement uniquement des acides aminés C-terminaux dans la protéine S6 crée une interaction avec la fente de liaison au substrat de la protéase (Fig. 2a, b). Cette interaction C-terminale plus un contact accidentel entre la surface de la feuille β de la tresse α/β et deux hélices α dans la protéase entraînent une inhibition de la protéase dans la plage de 50 nM. Sur la base de la structure de S6 dans le complexe 30S, la modification C-terminale peut ne pas avoir d'effets majeurs sur les interactions de liaison avec l'ARN ribosomal et la protéine S15 (Fig. 2a)43. Ainsi, la transition de la protéine de liaison à l'ARN à l'inhibiteur de protéase est probablement ininterrompue. Une insertion dans la boucle β1–α1 et une suppression de la boucle β2–β3 dans l'inhibiteur SI crée une topologie qui ressemble plus étroitement aux inhibiteurs naturels de type prodomaine44,46,61 et crée un motif α1β2β3 dans le pli S' qui est similaire au motif α1β3β4 du pli B. Cette similitude topologique rapproche le S'I d'une intersection avec le pli B. Ainsi, les nœuds SI et S'I sont à la fois des commutateurs fonctionnels et des points de branchement pour commuter le pli S dans les plis A et B, respectivement.

Les commutations entre les plis stables peuvent être induites par une seule mutation d'acide aminé ou une séquence terminale de suppression/ajout qui stabilise le pli S. Le bleu désigne un pli en S, le vert un pli en B et le rouge un pli en A. Les flèches grises relient les protéines qui ont été repensées sans commutateur de repli. Sb4 est observé avec deux plis simultanément. Les structures GA98 et GB98 proviennent respectivement des codes PDB 2LHC et 2LHD (réf. 32).

Les nœuds d'ingénierie aux intersections de plis ont nécessité la conception de séquences compatibles avec les interactions natives dans deux plis différents. Nous avons utilisé des règles simples pour ce faire. La première règle était d'aligner les topologies plutôt que de maximiser les similitudes de séquence. L'identification d'une topologie commune peut aider à déterminer un registre qui a moins de conflits irréconciliables. Par exemple, l'alignement topologique de l'hélice α1 du pli SI et de l'hélice α1 du pli A a facilité l'ingénierie du commutateur de pli, car les régions flanquant α1 du pli SI peuvent coder deux motifs de pli différents. Lorsque l'alignement topologique est médiocre, comme c'était le cas avec les plis S et B, il était utile de rechercher des variations naturelles dans les virages du pli le plus long pour créer un meilleur alignement. La variation des boucles et des virages dans un pli plus grand crée plus de liberté de conception et une plus grande probabilité de changements. Une fois qu'un alignement est choisi, la règle de base pour résoudre les conflits catastrophiques est de conserver les acides aminés d'origine lorsque cela est possible. Cela réduit les incertitudes liées à la conception informatique. La fonction d'énergie de Rosetta n'a pas été utilisée pour prédire un alignement favorable, mais était importante pour évaluer les mutations afin de résoudre les conflits une fois qu'un alignement avait été choisi.

La sélection de mutations compatibles avec deux ensembles d'interactions natives nécessitait des compromis dans l'énergétique de l'état natif de chaque pli individuel5,11. Un nœud peut être produit dans les cas où les deux plis alternatifs sont stables par rapport à l'état déplié. La stabilité par rapport à l'état déplié (c'est-à-dire un état avec peu de structure secondaire) a été déterminée par fusion de CD (Fig. 5). Il était instructif d'examiner la stabilité à la fois des formes courtes (56 résidus) et des formes longues d'une séquence de nœud putative. La stabilité indépendante du pli G peut être déterminée dans la forme courte sans l'antagonisme du pli S qui est présent dans la séquence plus longue. Les stabilités des protéines A1 et A2 sont d'environ -4 kcal/mol à 25 °C58 contre -5,6 kcal/mol pour la protéine GA native56. Les stabilités de B3 et B4 sont respectivement de -1,2 et -4,1 kcal/mol à 25 °C58 contre -6,7 kcal/mol pour la protéine GB native62. Pour les séquences plus longues, les ∆Gfolding de Sa1 et Sb3 sont de -5,3 et -3,5 kcal/mol, respectivement, à 25 °C58 contre -8,5 kcal/mol pour la protéine S6 native40.

Dans le cas des plis S, cependant, les effets énergétiques du pli G stable et intégré doivent également être pris en compte. Étant donné que les équilibres entre les deux états pliés et l'état déplié sont thermodynamiquement liés, l'énergie libre d'un passage à un pli G à partir d'un pli S (∆GG-fold/S-fold) est approximée par la différence de ∆Gfolding ( ∆∆Gfolding) entre les formes courtes et longues d'une protéine nodale. Par exemple, sur la base du ∆Gfolding pour A1 et Sa1, le ∆GA-fold/S-fold de Sa1 est de 1,3 kcal/mol. Ceci est cohérent avec la structure du pli S prédominant déterminée par RMN mais également avec la petite population de pli 3α suggérée par une faible liaison à la HSA. D'après les profils de dénaturation thermique de B3 et Sb3, le pli ∆GB/pli S prédit de Sb3 est de 2,3 kcal/mol, une valeur cohérente avec le pli S stable observé dans les expériences de RMN. Cependant, la séquence Sb3 approche également d'un point critique. Une substitution dans Sb3 qui stabilise le pli B (Y5L) déplace l'équilibre de Sb4 vers un mélange approximativement égal de plis B et S. C'est-à-dire que le ∆GB-fold/S-fold de Sb4 est d'environ 0 kcal/mol à 25 °C. Une autre substitution qui déstabilise le pli S (L67R) déplace la population de Sb5 vers un pli B stable (∆GB-fold/S-fold ≤ -5 kcal/mol) (Fig. 9).

L'existence de nœuds entre les plis a des implications pour l'évolution de nouvelles fonctions. Dans le cas du nœud S/A, tous les acides aminés de contact pour la HSA existent dans le pli S de l'inhibiteur de protéase Sa2I bien que dans une topologie cryptique. La suppression des acides aminés 67–99 (A2) entraîne une perte de la fonction inhibitrice et un passage de la tresse α/β à la 3α. L'acquisition de l'activité de liaison à la HSA (KD < 1 µM) résulte du démasquage des acides aminés cryptiques de liaison à la HSA via le fold switch (Fig. 2e). Ce niveau d'affinité de liaison pourrait être biologiquement pertinent puisque la concentration de HSA dans le sérum est > 500 µM63. Dans le cas du nœud S/B, le motif α1β3 contient tous les acides aminés de contact IgG et Sb3I a une certaine affinité pour les IgG (KD = 10 µM) et la protéase (KI = 50 nM). Dans ce cas, la mutation Y5L (Sb4) ou une délétion de 57–91 (B4) provoque un basculement de la tresse α/β vers la β-grasp et entraîne une liaison IgG plus étroite (KD ≤ 1 µM) (Fig. 2f ). Ce niveau d'affinité de liaison pourrait également être biologiquement pertinent puisque la concentration d'IgG dans le sérum est > 50 µM (ou > 100 µM de sites de liaison Fc)64. Nous avons précédemment montré qu'un pli A avec fonction de liaison HSA peut être remplacé par un pli B avec fonction de liaison IgG via des substitutions d'acides aminés simples qui changent les plis et démasquent les acides aminés de contact cryptiques pour les deux ligands29,32.

En conclusion, il a été possible de connecter trois plis communs dans un réseau de nœuds à haute identité qui forment des points critiques entre deux plis. Comme dans d'autres systèmes complexes, un petit changement dans une protéine près d'un point critique peut avoir un "effet papillon" sur la façon dont les plis sont peuplés. Cette propriété du code de repliement des protéines signifie que des protéines avec de multiples plis et fonctions peuvent exister dans des séquences d'acides aminés hautement identiques. Cela suggère que l'évolution de nouveaux plis et fonctions peut parfois suivre des voies mutationnelles ininterrompues.

La mutagénèse a été réalisée à l'aide des kits de mutagénèse dirigée Q5® (NEB). Les variants GA et GB ont été clonés dans un vecteur (pH0720) codant pour la séquence :

MEAVDANSLA QAKEAAIKEL KQYGIGDKYI KLINNAKTVE GVESLKNEIL KALPTEGSGN TIRVIVSVDK AKFNPHEVLG IGGHIVYQFK LIPAVVVDVP ANAVGKLKKM PGVEKVEFDH QYRGL

en tant que domaine de fusion N-terminal56. La croissance cellulaire a été réalisée par auto-induction29,65. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 3750 × g pendant 20 min et lysées par sonication sur glace dans 0,1 M KPi, pH 7,2. Les débris cellulaires ont été culottés par centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min. Le surnageant a été clarifié par centrifugation à 45 000 × g pendant 30 min. Les protéines ont été purifiées à l'aide d'une deuxième génération du système d'étiquettes de clivage par affinité utilisé précédemment pour purifier les protéines switch29,66. L'étiquette de deuxième génération entraîne une expression soluble de haut niveau des protéines de commutation et permet également la capture de la protéine de fusion en se liant étroitement à une protéase de traitement immobilisée via la séquence EFDHQYRGL C-terminale. Le chargement et le lavage étaient à 5 ml/min pour une colonne Im-Prot de 5 ml en utilisant un tampon courant de 20 mM KPi, pH 6,8. La quantité de lavage requise pour une pureté élevée dépend du caractère collant de la protéine cible et de la quantité de celle-ci liée à la colonne. Nous lavons généralement avec 10 volumes de colonne (CV) de solution de lavage suivis de 3 CV de NaCl 0,5 M, puis d'un tampon courant ~ 10 CV. Cela peut être répété si nécessaire. Les tirs de NaCl 0,5 M sont répétés jusqu'à ce que la quantité d'absorbance libérée avec chaque tir à haute teneur en sel devienne petite et constante. Toute la solution à haute teneur en sel est lavée avant d'initier le clivage. La protéine cible a été clivée de la colonne Im-Prot en injectant 15 mL de solution d'imidazole (0,1 mM) à 1 mL/min, 22 °C. La protéine clivée s'élue généralement sous la forme d'un pic net en 2 à 3 CV. La protéine purifiée a ensuite été concentrée à 0,2–0,3 mM, comme requis pour l'analyse RMN. Les colonnes ont été régénérées en injectant 15 mL de H3PO4 0,1 N (0,227 mL d'acide phosphorique concentré (85 %) pour 100 mL) à un débit d'environ 1 CV/min. La solution de lavage a été neutralisée immédiatement après l'extraction. Le système de purification est disponible auprès de Potomac Affinity Proteins.

Les protéines inhibitrices de protéase ont été purifiées en se liant au milieu Im-Prot puis en éliminant l'inhibiteur purifié avec du H3PO4 0,1 N. Les échantillons ont ensuite été immédiatement neutralisés en ajoutant 1/10 de volume de K2HPO4 1 M.

Les énergies de Rosette de toutes les structures conçues ont été générées à l'aide de la routine Slow Relax54. 1000 leurres ont été calculés pour chaque conception. Les coordonnées PDB et les paramètres d'énergie pour le leurre d'énergie le plus bas pour chaque conception sont inclus en tant que fichiers supplémentaires.

Les mesures de CD ont été effectuées dans 100 mM KPi, pH 7,2 avec un spectropolarimètre Jasco, modèle J-1100 avec un contrôleur de température Peltier. Des cellules de quartz avec des longueurs de trajet de 0,1 et 1 cm ont été utilisées pour des concentrations de protéines de 3 et 30 µM, respectivement. Les résultats d'ellipticité ont été exprimés en ellipticité moyenne des résidus, [θ], deg cm2 dmol-1. Les ellipticités à 222 nm ont été contrôlées en continu à une vitesse de balayage de 0,5°/min. La réversibilité de la dénaturation a été confirmée en comparant les spectres CD à 20 °C avant fusion et après chauffage à 100 °C et refroidissement à 20 °C.

L'affinité des protéines pour la HSA et l'IgG a été déterminée par leur rétention sur les ligands immobilisés. La HSA et l'IgG de lapin ont été immobilisées par réaction avec du Sepharose 4 Fast Flow activé par NHS (Cytiva) conformément aux instructions du fabricant. La concentration de HSA immobilisée était de 100 uM. La concentration d'IgG immobilisée était de 50 uM (c'est-à-dire 100 uM de sites de liaison Fc). Généralement, 0,2 mL d'une solution 5 µM de la protéine test a été injecté dans une colonne de 5 mL à un débit de 0,5 mL/min. La détermination de l'affinité de liaison suppose que la liaison est en équilibre rapide de telle sorte que le volume d'élution soit proportionnel à la fraction de protéine d'essai liée à 100 µM de sites de liaison. Les protéines qui sont complètement retenues après 20 volumes de colonne (CV) sont évaluées comme ayant un KD ≤ 1 µM. Les protéines complètement retenues sont extraites de la colonne avec du H3PO4 0,1 N à la fin de l'analyse.

Les constantes d'inhibition compétitive (KI) ont été déterminées à l'aide du substrat peptidique fluorogène QEEYSAM-AMC (7-amino-4-méthylcoumarine) acheté auprès d'AnaSpec Inc. et d'une protéase hautement spécifique et conçue connue sous le nom de RASProtease(I)49. Les constantes d'inhibition compétitive (KI) ont été mesurées en déterminant le KM (apparent) en présence de 0, 50 et 100 nM de chaque protéine inhibitrice. Les réactions ont été réalisées dans 100 mM de KPi, 10 mM d'imidazole, 0,005 % de tween-20, pH 7,0 à 25 °C avec 1 nM de RASProtease(I). Les concentrations de QEEYSAM-AMC utilisées pour déterminer KM et KM (apparent) étaient de 0,1, 0,5, 1, 2, 5 et 10 µM. Les taux initiaux ont été déterminés avec un lecteur de microplaques à fluorescence BioTek Synergy MT (Ex : 360/40, Em : 460/40) en mesurant la libération du groupe AMC fluorescent via l'hydrolyse de la liaison amide. Des protéases et des protéines inhibitrices très pures (≥ 98 %) ont été utilisées pour toutes les expériences cinétiques.

Des échantillons marqués aux isotopes ont été préparés à des concentrations de 0,2 à 0,3 mM dans un tampon de phosphate de potassium 100 mM (pH 7,0) contenant 5 % de D2O. Les spectres RMN ont été collectés à l'aide du logiciel Topspin3.6.1 sur des spectromètres Bruker AVANCE III 600 et 900 MHz équipés de cryosondes à triple résonance 1H/13C/15N à gradient Z. Des expériences de résonance double et triple standard (HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO et HNHA) ont été utilisées pour déterminer les affectations RMN de la chaîne principale. Les distances interprotons ont été obtenues à partir des spectres NOESY édités 3D 15N et NOESY édités 3D 13C avec un temps de mélange de 150 ms. NmrPipe67 a été utilisé pour le traitement des données et l'analyse a été effectuée avec Sparky68. Des expériences NOE hétéronucléaires bidimensionnelles {1H}-15N à l'état d'équilibre ont été acquises avec un délai de relaxation de 5 s entre les expériences. Les erreurs dans les NOE hétéronucléaires ont été estimées sur la base du niveau de bruit de fond. Les perturbations de déplacement chimique ont été calculées en utilisant Δδtotal = ((WHΔδH)2 + (WNΔδN)2)1/2, où WH est 1, WN est 0,2, et ΔδH et ΔδN représentent respectivement les changements de déplacement chimique 1H et 15N. Pour les expériences PRE sur Sb1, des échantillons de mutant de cystéine à site unique ont été incubés avec 10 équivalents de (1-oxyl-2,2,5,5-tétraméthylpyrroline-3-méthyl) méthanethiosulfonate (MTSL), Santa Cruz Biotechnology) à 25 ° C pendant 1 h et l'achèvement du marquage a été confirmé par spectrométrie de masse MALDI. Les échantillons témoins ont été réduits avec 10 équivalents d'ascorbate de sodium. Les intensités des pics d'amide du squelette des états oxydé et réduit ont été analysées à l'aide de Sparky. Les structures tridimensionnelles ont été calculées avec CS-Rosetta3.2 en utilisant les contraintes de déplacement chimique du squelette expérimental 15N, 1HN, 1Hα 13Cα, 13Cβ et 13CO et ont été soit validées par comparaison avec les modèles expérimentaux NOE du squelette (A1, B1, B4, Sb1) ou ont utilisé directement des NOE interprotons (Sa1, Sb2) ou des PRE (Sb1) comme contraintes supplémentaires. Un millier de structures CS-Rosetta ont été calculées à partir desquelles les 10 structures d'énergie les plus basses ont été choisies. Pour Sb3, CS-Rosetta n'a pas réussi à converger vers une topologie unique à faible énergie, produisant un mélange approximativement égal de plis de type S et B malgré les déplacements chimiques et le motif NOE indiquant un pli S. Dans ce cas, CNS1.169 a été utilisé pour déterminer la structure56, y compris les contraintes dièdres du squelette à partir des données de déplacement chimique à l'aide de TALOS-N70. Les résonances du squelette pour l'état S de Sb4 ont été attribuées à l'aide de méthodes de triple résonance comme ci-dessus, dans des conditions où l'état S est plus favorablement peuplé (30 ° C, 100 mM KPi, 200 mM chlorure de sodium, pH 7, 0). Les attributions d'amide ont ensuite été transférées au spectre HSQC 1H-15N bidimensionnel de Sb4 à 25 ° C dans 100 mM de KPi, pH 7, 0. Les NOE inter-protons pour l'état S de Sb4 ont été obtenus à 30 ° C / condition de sel élevée, en utilisant un spectre NOESY 3D édité 15N avec un temps de mélange de 150 ms. Un spectre HSQC 1H – 15N à échange ZZ bidimensionnel a été enregistré sur Sb4 en utilisant un temps de mélange de 300 ms (25 ° C, 100 mM KPi, pH 7, 0) 71, 72. Les structures protéiques ont été affichées et analysées à l'aide de PROCHECK-NMR73, MOLMOL74 et PyMol (Schrodinger)55.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les structures RMN générées dans cette étude ont été déposées dans le PDB : [https://doi.org/10.2210/pdb7MN1/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb7MQ4/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb7MN2/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb7MP7/pdb] ; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000083] ; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000084] ; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000085]. Les assignations RMN ont été déposées au BMRB : [https://doi.org/10.13018/BMR30901] ; [https://doi.org/10.13018/BMR30902] ; [https://doi.org/10.13018/BMR30904] ; [https://doi.org/10.13018/BMR30905] ; [https://doi.org/10.13018/BMR50907] ; [https://doi.org/10.13018/BMR50909] ; [https://doi.org/10.13018/BMR50910] ; [https://doi.org/10.13018/BMR51719]. Les structures référencées dans cet article sont accessibles au public dans l'APB : [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb2VDB/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb1FCC/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb6UAO/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb2LHC/pdb] ; [https://doi.org/10.2210/pdb1RIS/pdb]. Les données sources sont fournies avec ce document. Les modèles de conception sont fournis sous forme de fichiers dans les données source. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health Grant GM62154 (à PB et JO) et 5R44GM126676 (à PB). L'installation de RMN est soutenue par l'Université du Maryland, l'Institut national des normes et de la technologie et une subvention de la Fondation WM Keck. Nous remercions également les Drs. Nese Sari et Louisa Wu pour leur lecture critique du manuscrit et leurs nombreux commentaires réfléchis. La mention de produits commerciaux n'implique pas de recommandation ou d'approbation par le NIST.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Biao Ruan, Yanan He, Yingwei Chen.

Potomac Affinity Proteins, 11305 Dunleith Pl, North Potomac, MD, 20878, États-Unis

Biao Ruan, Yingwei Chen, Eun Jung Choi, Dana Motabar, Richard Simmerman et Philip N. Bryan

Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Université du Maryland, 9600 Gudelsky Drive, Rockville, MD, 20850, États-Unis

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Département de bioingénierie, Université du Maryland, College Park, MD, 20742, États-Unis

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Laugh Solomon, Thomas Kauffman et John Orban

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D. Travis Gallagher

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Correspondance à John Orban ou Philip N. Bryan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Ruan, B., He, Y., Chen, Y. et al. Conception et caractérisation d'un réseau de commutation de repliement protéique. Nat Commun 14, 431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36065-3

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Reçu : 14 juillet 2022

Accepté : 13 janvier 2023

Publié: 26 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36065-3

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Communication Nature (2023)

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